电致化学发光葡萄糖传感器的研制

电致化学发光葡萄糖传感器的研制

1固定化方法的应用电致化学发光（cel）是在化学发光的基础上发展起来的一种化学发光法。它是结合电极反应和其他化学发光方法的。利用葡萄糖氧化酶(GOD)催化氧化葡萄糖生成H2O2可以构建葡萄糖ECL传感器。在ECL葡萄糖传感器研究中,GOD的固定方法是一个重要课题。常用的酶固定化方法有吸附法、包埋法、共价键合法及交联法,电化学聚合法。这些方法制备ECL酶传感器过程烦琐、复杂,电极表面敏感膜不易更新。在酶传感器中采用纳米材料为载体,不仅可以增加酶的固定量和稳定性,而且还可以提高酶的催化活性,进而提高酶电极的响应灵敏度。Fe3O4磁性纳米粒子具有纳米粒子的诸多优点,又具有非常好的生物相容性,在外加磁力的作用下能非常方便地实现电极敏感膜的更新,故在酶传感器研究中得到了广泛应用[10,11,12,13,14,15]。但是在ECL葡萄糖传感器中,使用Fe3O4磁性纳米粒子固定GOD还未见报道。本研究通过交联剂将GOD共价固定在Fe3O4磁性纳米粒子表面,再通过磁力将此固载酶的磁性纳米粒子修饰在SPCE表面,从而制成了易更新的酶传感器,并用于葡萄糖的ECL分析。2实验部分2.1仪器、试和仪器MPI-E型电致化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司);M1703型红外光谱仪(Perkin-Elmer公司);三电极系统:工作电极为自制的磁性纳米粒子固定酶修饰电极(GOD/Fe3O4/SPCE/CME),参比电极为Ag/AgCl饱和KCl电极,铂丝为对电极;Bransonic200超声清洗仪(德国BransonUltraschall公司);pHS-2C型精密酸度计(上海雷磁精密仪器有限公司)。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS,98%,AlfaAesar公司);葡萄糖氧化酶(GOD,120U/mg,Sigma公司);标准葡萄糖储备液,放置过夜后使用,保存于4℃冰箱中。鲁米诺(>98%,Fluka公司);戊二醛(25%,上海化学试剂厂);其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水(18.2MΩ·cm)。2.2修饰电极的制备参考文献,取3cm长的铁棒(外径2.55mm)和2cm长的玻璃管(3.0mmi.d),磨平铁棒和玻璃管的两端,用水洗净。按一定比例混合固体石蜡和碳粉,加热熔化石蜡,均匀搅拌,制得石蜡碳糊。把铁棒插入玻璃管中距底部约0.5mm,形成一个凹坑,趁热将石蜡碳糊封装进此凹坑,填平,冷却,除去玻璃壁外的沾粘的碳糊,并在光滑打印纸抛光电极表面。然后分别用HNO3(1∶1,V/V)、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极。在1.0mol/LH2SO4溶液中采用循环伏安(CV)法活化作为工作电极的SPCE,扫描范围1.2～-1.2V。再于5mmol/LK3Fe(CN)6溶液中循环扫描,扫描范围改为0.5～-0.2V。重复上述步骤直至得到峰形良好的一对可逆氧化还原峰。按照n(Fe2+)∶n(Fe3+)=1∶1.75称取适量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,溶于水中。搅拌下快速加入适量2.0mol/LNaOH溶液,调pH值至11.0,室温下搅拌0.5h,迅速升温到75℃,熟化0.5h,整个过程都在氮气的保护下进行,得黑色悬浮液。超声15min,磁铁分离不溶物,用水洗涤至溶液呈中性。在75℃下真空干燥,得粉末,4℃下密闭保存在。取20mL乙醇,加入50mgFe3O4纳米粒子粉末,超声分散,之后加入0.2mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷(98%),在氮气的保护下,25℃搅拌12h制得氨基化的磁性纳米粒子,用无水乙醇、水超声清洗后定容至20mL备用。取2.0mL上述溶液于5mL试管中,晾干,再于试管中加入2.0mL0.25%戊二醛,混旋30s后,放入4℃冰箱冷藏1h,之后水洗并晾干,再加20g/LGOD溶液2.0mL,于4℃冰箱中保存12h,制得GOD修饰的磁性粒子溶液(GOD/Fe3O4)。图1为磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意图。SPCE电极面朝上,用磁铁吸住电极上端铁芯,滴加15μLGOD/Fe3O4粒子在电极表面,制得酶修饰电极(GOD/Fe3O4/SPCE/CME)。测定时将电极面对准光电倍增管检测方向。每次更新电极时,移去磁铁,水洗去磁性复合粒子,之后重复上述过程以更新电极。2.3鲁米诺的ecl行为ECL传感器的原理如图2。GOD/Fe3O4复合磁性纳米粒子通过外加磁场而修饰在SPCE电极表面。此时,溶液中的葡萄糖与溶解氧发生GOD酶促反应,生成H2O2。同时,溶液中的鲁米诺在修饰电极表面发生氧化,鲁米诺氧化物与H2O2发生ECL反应。GOD/Fe3O4复合磁性纳米粒子的存在促进了鲁米诺的氧化和H2O2生成。在本实验中,室温下,将10mL含一定浓度的葡萄糖的0.5mmol/L鲁米诺-0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液(pH=8.0)转至石英烧杯中,然后采用三电极系统进行测试,并测定ECL的强度。扫描范围为0.2～1.4V(vs.SCE),扫速为50mV/s。光电倍增管高压600V,采样速率10T/S,放大倍数3,测量时间60s。SPCE不用时置于冰箱中4℃下保存。3结果与讨论3.1酶复合磁元素地球化学特征用激光散射仪(英国Malvern公司)测定Fe3O4纳米粒子粒径。从图3可见,本实验所制备的Fe3O4磁性粒子粒径主要分布在12～22nm之间。说明磁性纳米粒子已经达到纳米级,且粒径分布较为集中,因此,可用于后续实验。用红外光谱表征Fe3O4粒子表面氨基化修饰前后的变化。由图4可见,在Fe3O4粒子表面功能化修饰了氨基基团,Fe3O4粒子与氨基化Fe3O4粒子都具有Fe3O4粒子特征峰(583.235cm-1);氨基化Fe3O4粒子具有Si-O的伸缩振动特征峰(1409.675cm-1)和氨基弯曲振动特征峰(1638.335cm-1)。用振动样品磁强计(PAR115型)对移去磁铁而洗脱获得的酶复合磁性粒子进行磁力测量。复合粒子矫顽力较低,同时未见明显的剩磁和磁滞现象,其比饱和磁化强度σ仅为42.1emu/g(图5)。由此可见,Fe3O4/GOD复合粒子具有较强超顺磁性即在外磁场存在下有磁性,外撤除磁场则磁性消失,故可用于磁性分离。3.2cv实验过程Fe3O4/GOD(a)和Fe3O4(b)粒子分别修饰的SPCE,在10mL含0.1mmol/L鲁米诺和1.0mmol/L葡萄糖+0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液(pH=8.0)中进行CV实验所得到ECL图(见图6)。实验条件:电位扫速为50mV/s,扫描范围为0.2～1.4V,采样速率10T/S,放大倍数3。由图6可见,修饰在电极表面的Fe3O4粒子表面成功地共价固定了GOD,从而催化氧化葡萄糖生成鲁米诺ECL所需的H2O2。3.3鲁米诺ecl的响应研究了3种缓冲液:0.1mol/L硼酸钠、0.1mol/LHAc-NaAc和PBS(pH=8.0)作为支持电解质的影响。结果表明,0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液中ECL响应最高。鲁米诺的ECL反应需在弱碱性条件下进行,考虑到葡萄糖氧化酶的生物活性受pH值影响较大,本研究考察了pH在7.0～9.5时ECL强度的变化。其中鲁米诺浓度为0.1mmol/L,葡萄糖浓度为1.0mmol/L。当pH=8.0时,鲁米诺的ECL强度最大,本实验选取pH=8.0。酶的催化活性受温度影响较大。本实验用集热式恒温加热磁力搅拌器控制水浴温度,考察了20～60℃范围内酶电极的电流响应。当温度达到40℃时,响应最大。综合考虑温度对葡萄糖氧化酶电极寿命的影响,本实验均在室温25℃下进行。3.4鲁米诺溶液中cl强度的变化本实验考察了鲁米诺的浓度在0.01～1.2mmol/L范围内对ECL强度的影响(图7)。由图7可知,随着鲁米诺的浓度由0.01mmol/L增大到0.5mmol/L时,溶液的ECL强度快速增大,之后趋于平稳饱和。因此,实验中鲁米诺的浓度为0.5mmol/L。3.5标准曲线及检出限取10mL石英小烧杯,加入含一系列不同浓度的葡萄糖0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液(pH=8.0)10mL,此时鲁米诺浓度为0.5mmol/L,按上述方法测定ECL的强度(图8)。葡萄糖在1×10-5～1.0×10-2mol/L浓度范围内与ECL强度呈良好的线性关系:I=65.4374C+23.9017,r=0.9987;检出限为1μmol/L;酶电极的响应时间约为10s。3.6纳米粒子的检测通过移除ECL葡萄糖传感器上方的磁铁,用水冲SPCE电极表面,在0.5mol/LHCl中清洗0.5min,从而去除磁性复合粒子。重复2.2.2节的修饰过程,可实现磁性复合粒子的更新。每次电极更新后对1.0mmol/L的葡萄糖进行测定,其RSD=3.9%(n=5)。而对于5批次相同条件下制得的传感器,其RSD=4.5%。考察一个月内组装有磁性复合粒子的工作电极对葡萄糖响应情况(不使用时,电极放置在4℃冰箱中保存)。结果表明,7天内电极响应基本不变,CV和ECL曲线形状也基本不变;14天后ECL强度约为原来的95%;1月后ECL强度下降85%。显然,用本实验方法固定GOD在Fe3O4纳米粒子表面,能在微环境下保持生物蛋白的活性,从而获得较好的稳定性。考察了一些常见干扰物质对测定5.0×10-5mol/L葡萄糖的影响。结果表明,10倍的尿酸和抗坏血酸对葡萄糖的检测的影响均<5%,说明本方法选择性好,这归功于酶促反应特异性和ECL的高灵敏度。3.7加标回收率测定结果按照实验方法对人血清样品(桂林理工大学附属医院提供)中葡萄糖的含量进行测定,结果见表1。结果表明,本