rca法检测痰标本中结核分枝杆菌利福平的应用

rca法检测痰标本中结核分枝杆菌利福平的应用

近年来，分枝杆菌的抗剂率不断提高，尤其是多重抗剂菌的比例不断增加，耐药性的表现为对主要一线药物的抗剂和多种药物的抗剂。因此，我们尤其重要地快速、准确、可靠地检测核糖杆菌对主要一线药物的耐药性，以及早期有效化疗和核电站疫情的控制。利福平(rifampin,RIF)是重要的临床一线抗结核药物,据统计约90%以上RIF耐药菌株对异烟肼也耐药,因此RIF耐药也可作为MDR-TB的标志。基于改良罗氏培养基进行结核分枝杆菌的药敏试验是诊断结核分枝杆菌药物敏感性的金标准,该方法技术简单、经济、易推广,可进行11种一线、二线药物的药物敏感试验,但培养阳性率较低,细菌生长缓慢,时间较长(2~3个月),不能满足临床早期诊断与治疗的需要。滚环扩增是近年来发展起来的一种恒温扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶基因的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子水平。因此,RCA技术在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等方面检测中具有很大的应用价值和潜力。本文以传统药敏试验绝对浓度法为金标准,评估RCA技术快速直接检测涂阳肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌对利福平的敏感性,从而评价该技术在我国的实际临床应用的可能和价值。1来自本地格式的资源1.1核电站的树枝杆菌H37Rv标准菌株(ATCC27294)本实验室保存。1.2气本组患者采集2012年8至12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院的涂片阳性的初治肺结核患者24h痰标本12份,复治肺结核患者晨痰标本20份,共32份。2主试剂和设备2.1特效药利福平(RIF)(SIGMA公司,批号080M15106V)2.2table-pcr检测结核分枝杆菌核酸提取试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司);1%TAE缓冲液,琼脂糖;2×TaqPCRMastermix酶,100bpDNAMarker(北京天根生化技术有限公司);Pfu连接酶(美国安捷伦科技公司);ExoI外切酶,ExoIII外切酶,SybGreen染料(大连TaKaRa公司),20%吐温80,AlarmarBlue指示剂(批号020611A,美国BIO-RAD公司)。2.3利福平储液的制备称取80mg利福平溶于1mLDMSO中(80mg/mL)。2.4pcr系统和成像系统RealtimesteponeplusPCR仪(型号272004559,上海ABI公司);电热恒温水浴锅;德国Eppendorf梯度PCR仪(型号6325ZQ011275),DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);Tanon-4200全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);CO2培养箱。3方法3.1通过处理痰样3.1.1溶液的配制约2mL的痰液中加入2~3倍的4%NaOH,摇匀,室温下放置30min左右充分液化;取200μL接种于7H11培养基,置于5%CO2培养箱中培养3~4周。3.1.2热离心时间(采用结核分枝杆菌核酸提取试剂盒方法)取0.5mL液化痰至1.5mL离心管中,加入0.5mL4%NaOH室温放置10min后15000r/min离心5r/min;取上清,沉淀加无菌生理盐水1mL混匀,15000r/min离心5min;加50μLDNA提取液充分混匀,沸水浴10min,转至4℃静置过夜以保证充分裂解;10000r/min离心5min,取上清做PCR反应。3.2pcr扩增3.2.1热点突变区的设计和合成37RvrpoB基因的标准序列。结核分枝杆菌rpoB基因全长3519bp,其507~533位氨基酸密码子被称为“热点突变区”。设计引物扩增涵盖此突变区的835~1463bp的DNA片段(见表1)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。扩增片段:629bp。引物的特异性及是否形成引物二聚体通过PrimePremier5.0进行分析检验。3.2.2dna模板选择使用25μL总反应容积各1μL上下游引物(10μmol/L),12.5μL2×TaqPCRMasterMix,3μLDNA模板及7.5μL去离子水。3.2.3pcr扩增程序94℃2min;94℃15s,62℃30s,72℃1min,共40个循环;最后72℃延伸10min。3.2.4扩张完成后，将其保存在4c下3.3判定PCR扩增产物将5μLPCR产物与1μL10×loadingbuffer混匀并上样,104V电压;40min后,终止电泳,凝胶成像仪中拍照。3.4rca的环化3.4.1检测来自大连TAKARA公司合成(见表1)。3.4.2合成ligae及7.5lpcr产物使用10μL总反应容积:1μL探针(1μmol/L),1μLbuffer,0.5μLPfuligase及7.5μLPCR产物。3.4.3环境处理95℃,62℃循环1次;95℃,62℃循环8次。3.5rca检测3.5.1lexoii表达使用20μL总反应容积:10μL环化产物,1μLbuffer,0.5μLEXOI外切酶,0.1μLEXOIII外切酶及7.4μL去离子水。3.5.2水解反应方案37℃60min,95℃3min。3.6ybger染料法采用realtimePCR相对定量,SybGreen染料法:应用RCA扩增引物,在等温条件下将环形探针扩增。在反应体系中,加入过量SybGreen荧光染料。3.6.1扩大引物的合成和设计RealTimePCR检测引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成(见表1)。3.6.2复合无酶水检测使用25μL总反应容积各1μL上下游引物(10μmol/L),3μL环化产物,12.5μLSybGreen及7.5μL去离子水。无酶水组检测使用25μL反应容积:各1μL上下游引物(10μmol/L),3μL无酶水,12.5μLSybGreen及7.5μL去离子水(无酶水组以无酶水为DNA模板,体系其他成分一样,目的排除试剂的污染)。96孔板排列分布情况见表2。根据荧光信号的扩增曲线图进行分析,见图1。3.7突变位点和分型分析结核分枝杆菌rpoB基因突变情况将32株结核分枝杆菌PCR产物送至北京华大基因公司测序,结果与rpoB标准序列比较分析,确定突变位点和分型。3.8菌株鉴定结果用接种环取一环培养基上的菌落,研磨并配置1麦氏管浓度菌悬液,接种至含利福平(50mg/L,250mg/L)的药敏试验培养基,放入5%CO2培养箱中,37℃培养4~6周,观察结果。4结果4.1dna的dna采用结核分枝杆菌核酸提取试剂盒方法提取32份痰涂片阳性的DNA。以提取的DNA为模板,应用序列特异性引物进行扩增,以1%琼脂糖凝胶电泳,32个泳道在600~700bp处均可见条带,条带清晰明亮(见图2)。4.2临床菌株突变由RCA检测结果(表3)说明,32株临床菌株共有24株突变,其中516G、526G、526C和531各占2、5、7、9株,另有516/526C联合突变1株。4.3lrap关键因素对产品鉴定的影响对32份痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因PCR扩增的目的片段进行DNA单项测序,证实扩增产物的目的片段均为580bp。序列结果与GenBank中所公布的结核分枝杆菌标准菌株H37RVrpoB基因片段核苷酸序列进行BLAST对比,其中8株菌株未发现突变,其余24株菌株中均发生突变,总突变率为87.5%,涉及4种突变类型(见表4);其中1株发生联合突变。由测序结果可知,24株临床结核分枝杆菌rpoB基因均有碱基突变,与RCA检测结果一致。4.4抗结核药物利福平敏感菌株对32株结核分支杆菌临床分离株进行药物敏感性试验,结果显示对抗结核药物利福平敏感的菌株为8株,25%(8/32);耐药菌株为24株,75%(24/32)。4.53分子质量检测(1)RCA结果,32株结核分枝杆菌临床分离株中,24株为利福平耐药菌株。与测序结果均一致,均发生在“RRDR”的81个碱基内。其中23株单位点突变,516位2株,526位12株,531位9株,另有1株516和526双位点突变。在我们所检测的24株突变株中,单一位点突变的23株皆为错义突变,占所有突变株的95.8%。9例531位突变皆为TCG→TTG(Ser→Leu)。10例526位突变中,4例为CAC→CGC(His→Arg),2例CAC→CCC(His→Pro),2例子CAC→AAC(His→Asn),2例CAC→GAC(His→Asp),1例CAC→TAC(His→Tyr),1例CAC→CTC(His→Leu)。2例516位突变分别为GAC→GTC(Asp→Val)和GAC→TAC(Asp→Tyr)。1株两位点联合突变的菌株,为516位和526位的组合,其中516位的突变形式为GAC→TAC(Asp→Tyr),而526位的突变形式为CAC→CGC(His→Arg)。(2)DNA测序相比,RCA检测初治和复治涂阳肺结核患者RIF耐药的灵敏度和特异度达100%。(3)以传统药敏试验方法为金标准,与传统药敏试验相比,RCA检测初治和复治涂阳肺结核患者RIF耐药情况的检测不具有统计学差异(P>0.05),灵敏度和特异度分别为91.6%和75.0%,Kappa值为0.87,阳性预测值和阴性预测值分别为91.7%和75%(见表6)。5检测结果基本见表1:本检测方法的基本原理及与传统药敏试验检测到痰标本的检测全球耐药结核病形势严峻,利福平耐药在临床的比例很高,而且是MDR-TB,XDR-TB的标志,研究表明96%的利福平耐药存在rpoB基因突变,虽然已经发展很多分子生物学的诊断技术,但临床上大多仍然应用绝对浓度法的表型测定,所以,建立和评价快速灵敏特异的耐药监测方法是应对我国结核病高耐药率流行亟需解决的问题。本研究利用RCA技术直接用于痰标本中结核分枝杆菌利福平药物敏感性的检测,针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区RRDR常见的突变位点及形式,设计并合成rpoB基因突变的六个探针进行快速突变富集检测。与DNA测序相比,RCA检测初治和复治涂阳肺结核患者利福平耐药情况完全一致。与传统药敏试验相比,本检测方法检测利福平耐药的灵敏度和特异度分别为91.6%,75.0%,具有较好的真实性;本检测方法检测利福平耐药的Kappa值为0.87。根据Kappa值判定标准:κ≤0.40为一致性较差,0.40<κ≤0.60为中度一致,0.60<κ≤0.80为较高度的一致性,κ>0.80为极好的一致性,说明RCA技术检测利福平耐药性的一致性很高,具有较高的可靠性。以传统药敏试验方法为金标准,与传统药敏试验相比,本检测方法直接对涂阳肺结核患者的痰标本进行检测,而传统药敏试验是基于改良罗氏培养基培养阳性的标本进行药物敏感性试验;与传统药敏试验所需的2~3个月相比,本检测方法几个小时内既可得到结果;且具有较高的灵敏度和较高的特异性。对32份痰标本的RCA结果、DNA测序结果和药物敏感性试验进行比较,28株结果均一致。另有药敏试验为耐药的菌株RCA结果敏感,DNA测序未见突变的菌株2株,这种情况有类似报道,且占到相当的比例。原因可能是虽然目前已把rpoB突变作为结核分枝杆菌耐RIF的标志,但rpoB突变并不能完全解释结核分枝杆菌对RIF产生耐药性的分子机制。目前尚有5%左右的耐RIF结核分枝杆菌未能在rpoB突变热点区检出突变。已检测出的rpoB基因突变多达20余种,这些突变是否均能导致耐药性还未能完全阐明。突变位点位于扩增的629bp的rpoB基因片段检测区之外,或还存在其他的耐药机制:在rpoB核心突变区之外的位置发生突变;RNA聚合酶其它亚基的突变;影响RIF渗透性的细菌胞膜的改变等。同时,由于引物设计只限于扩增目前已知的突变的高发区域,因此也可能遗漏非高发区域的突变类型,有待在后续研究中进一步扩大样本量并增加针对其他位点的突变进行检测。另有2株菌株RCA结果与测序结果均为531位突变,而药敏试验结果为敏感,可能与传统药敏试验方法临界浓度的设定有关。本研究是应用RCA方法对痰标本中结核分支杆菌利福平敏感性直接检测的初步研究,还存在一些不足之处。首先,样本量较小,还不足以进行全面的分析;其次,本实验采用的滚环扩增涉及了6种常见的突变类型探针,未能涵盖rpoB基因扩增范围内的其它类型突变,还需要在后续研究中进一步增加突变探针类型,如509位,510位,512位,513位,514位,515位,522位,533位等。在滚环扩增中,扩增结果与酶的选择、温度等条件密切相关,因此还需进一步