高效液相色谱法测定水稻及其环境中虫威残留量

高效液相色谱法测定水稻及其环境中虫威残留量

1虫威在稻米中的残留动态iikulmuzi成立于1992年，并于2001年注册和销售了美国杜邦公司。这是钠通道抑制剂。其作用机制主要是阻止昆虫神经中的钠离子通道，使神经元失去功能并最终导致目标昆虫死亡。茚虫威属低毒杀虫剂,无致癌、致畸和致突变作用,是一种广谱高效的杀虫剂,且与其它杀虫剂不存在交互抗性,可用于害虫的综合防治和抗性治理,但其对非靶标生物仍具有较高的毒性。目前,一些国家已经制定了茚虫威在水稻中的最高残留限量(MRL)标准,如欧盟规定茚虫威在稻米里的MRL值为0.02mg/kg,韩国规定其在稻米里的MRL值为0.1mg/kg,而我国还未制订茚虫威在水稻中的MRL值,因此,建立水稻中茚虫威的残留检测方法十分必要。近年来,国内外对茚虫威的残留分析主要集中在蔬菜、水果、茶叶、鱼肉、鸡肉等样品的测定,常用的检测方法包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法、液相色谱串联质谱法、超高效液相色谱串联质谱法等。彭筱等采用气相色谱法测定了茚虫威在水稻上的残留消解动态,有关采用高效液相色谱法研究茚虫威在水稻上的残留消解动态国内尚未见报道。笔者采用高效液相色谱———二极管阵列检测器(HPLC-PDA)建立了茚虫威在水稻中的残留分析方法。该方法成本低、提取净化过程简单、检测快速、灵敏度高,糙米中最低检测浓度为0.01mg/kg,低于欧盟、韩国规定的茚虫威在稻米中的最高允许残留量。利用该方法研究了2012年3%茚虫威超低容量液剂在湖南省宁乡县、江苏省镇江市、河南省新乡市三地水稻中的残留消解动态,为杀虫剂茚虫威在水稻上的安全使用提供了技术基础,亦为农药管理部门制订其在水稻上的MRL值提供了科学依据。2实验部分2.1仪器的选择仪器:LC-20AD岛津高效液相色谱仪(配PDA检测器及LC-Solution色谱工作站,带SIL-20AXR自动进样器,日本岛津公司)、BL310sartorius型百分之一天平(德国赛多利斯公司)、AL204型万分之一电子天平(瑞士梅赫勒.托利公司)、RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、HY-B1型回旋震荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)、KQ3200超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。试剂:茚虫威标准品(纯度98%);乙腈(色谱纯);丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷(均为AR);无水硫酸钠(使用前400℃烘5h以上);弗罗里硅土(用前650℃活化3h,再加5%的水去活)。2.2动态测定项目田水及土壤中消解动态实验:实验小区面积50m2,施药剂量135ga.i/hm2,喷雾施药,施药1次,采样距施药间隔2h和1、3、7、14、21、30、45、60d。田水动态样品采用随机法10点取样,-20℃下存放备用;土壤动态样品采用随机法8点取样,-20℃下存放备用。水稻植株中消解动态实验:重复小区数3次,小区面积30m2,施药时期为水稻分蘖期,施药剂量为135ga.i/ha,施药次数1次,采样距施药间隔2h和1、3、7、14、21、30、45、60d。水稻植株动态样品采用随机法取样,四分法缩分,-20℃下存放备用。分别测定田水、土壤及植株中茚虫威的残留量,获得对应的消解动态曲线和半衰期。另设空白实验区,施药前,采集田水、土壤及植株样品,用作空白对照。2.3分析2.3.1检测波长和测定波长迪马钻石二代C18色谱柱(5μm,200mm4.6mmi.d.);流动相为乙腈-水(60∶40,v/v)保持22min,乙腈-水(95∶5,v/v)保持5min,乙腈-水(60∶40,v/v)保持8min;流速为1mL/min;检测波长为310nm;柱温为40℃;进样量为20μL;茚虫威的保留时间约为20.9min。外标法定量。2.3.2乙腈定容测田水:量取20mL己过滤的水样于125mL的分液漏斗中,用二氯甲烷(30mL×3)萃取,合并有机相后于40℃水浴旋转蒸发至近干,用2mL乙腈定容,待测。土壤、植株、稻米、稻壳:称取20g土样(己剪碎的植株试样10g、己粉碎的稻米样品20g、稻壳样品5g)于100mL的锥形瓶中,定量加入60mL提取液[v(丙酮)∶v(二氯甲烷)=2∶1],3g氯化钠,超声5min,振荡提取30min,提取液经无水硫酸钠过滤后,取30mL于100mL圆底烧瓶中,于40℃水浴旋转蒸发至近干,冷却后过柱净化。2.3.3浓缩残留物的制备层析柱(200mm×20mm)中由下至上依次填装8g无水硫酸钠、5g弗罗里硅土、8g无水硫酸钠,依次用乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯(6∶4,v/v)混合液各10mL预淋层析柱,弃去,将浓缩残留物用5mL乙酸乙酯溶解上样,以石油醚-乙酸乙酯(6∶4,v/v)混合液10mL×3淋洗,收集洗出液于圆底烧瓶中,于40℃水浴旋转蒸发至近干,冷却后2mL乙腈定容,待测。3结果与讨论3.1样品前提取剂为复合剂的提取回收率根据茚虫威溶解度性质(25℃下,几乎不溶于水,乙腈中139mg/mL;乙酸乙酯中160mg/mL;二氯甲烷、丙酮中>250mg/mL),本实验除田水样品可利用其溶解度性质差异,以二氯甲烷进行液液分配后直接提取即能达到满意的回收率外,其它基质样品需采用混合提取剂,方能达到满意回收。实验分别选用了乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙腈作为水稻植株的提取剂,结果表明:乙酸乙酯和二氯甲烷提取回收率较低,分别为56.32%和68.43%,原因可能是乙酸乙酯和二氯甲烷亲水性差,在提取过程中样品不易被浸润。乙腈和丙酮提取回收率较高,分别为80.33%和89.42%。而当使用丙酮-二氯甲烷(2∶1,v/v)混合溶剂提取时,提取回收率可达97.72%,故本实验选择丙酮-二氯甲烷(2∶1,v/v)混合溶剂进行提取。与单一溶剂相比,该混合溶剂对本实验除田水以外的所有基质均显示出了良好的提取效率。3.2净化填料的筛选水稻植株、稻壳中含有大量的色素和杂质,如何去除色素和杂质对目标物检测的干扰是本实验的一个重要环节。实验中,对常用的净化填料弗罗里硅土、中性氧化铝、活性炭进行了尝试,结果见图1。图1表明,在石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-丙酮、甲醇3种淋洗体系的淋洗下,选用弗罗里硅土或中性氧化铝与一定量的活性炭混合作为吸附剂,去除色素的效果好,但茚虫威标准溶液的淋出率最多只有80%,可能是活性碳在吸附色素的同时也吸附了一部分目标物;使用中性氧化铝作为净化填料,茚虫威的淋出率低于78%;而使用弗罗里硅土作为净化填料,净化效果比较理想,茚虫威的淋出率在98%以上,因此选用弗罗里硅土作为净化填料。实验比较了3种不同淋洗剂对茚虫威的洗脱效果。结果发现:以二氯甲烷-丙酮(1∶1,v/v)和甲醇作洗脱剂,每次10mL,洗脱3次,茚虫威的洗脱率分别达到98.50%和95.33%。但洗脱下来的杂质也较多,干扰目标峰的测定。以石油醚-乙酸乙酯(6∶4,v/v)作洗脱剂,每次10mL,洗脱3次,茚虫威的洗脱率高达100.1%,且洗脱下来的杂质较少,不干扰目标峰的测定。因此选择石油醚-乙酸乙酯(6∶4,v/v)作为洗脱剂。3.3检测波长的确定采用二极管阵列检测器进行全波长扫描(见图2)发现,在310nm处,茚虫威有最大的吸收,因此,选择310nm为检测波长。3.4流动相及洗脱时间实验选用迪马钻石二代200mm′4.6mm(i.d)C18柱对于茚虫威标准品能够呈现良好的线性,且峰形对称,故该柱可以作为分离茚虫威的比较理想的色谱柱。实验选用了不同体积比例的乙腈-水、甲醇-水作为流动相,研究结果表明,在乙腈-水(60∶40,v/v)的条件下,茚虫威的保留时间为20.9min,且能与杂质完全分离,峰形尖锐。因水稻基质较为复杂,为避免弱极性杂质对在上述流动相条件下不出峰而造成对后面样品的干扰,实验时选用梯度洗脱,即流动相:乙腈-水(60∶40,v/v),保持22min;乙腈-水(95∶5,v/v)保持5min;乙腈-水(60∶40,v/v),保持8min。3.5标准曲线及检出限称取一定量的茚虫威标准品用乙腈溶解配制成500mg/L的标准溶液,再分别稀释成0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10mg/L的不同浓度的系列标准溶液,采用上述色谱条件进行检测,以茚虫威的质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标作回归分析,得到标准曲线方程为:y=44519x+266.73,r2=0.9999。结果表明茚虫威在0.05~10mg/L质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。样品处理后测定,得出茚虫威在田水、土壤、稻米中的检出限均为0.003mg/kg,在植株、稻壳中的检出限分别为0.006mg/kg、0.012mg/kg;茚虫威在田水、土壤、稻米中的定量限均为0.01mg/kg,在植株、稻壳中的定量限分别为0.02mg/kg、0.04mg/kg。3.6准确度和精密度在田水、土壤、植株、稻壳和稻米空白样品中分别进行3个水平的添加回收实验,另设空白对照。每个浓度水平在1d内重复测定5次,在3d内每天重复测定5次,考察其日内和日间的准确度和精密度。添加回收实验结果表明(见表1)。茚虫威在水稻中的日内平均添加回收率为81.9%~101.2%,标准偏差为0.2%~5.9%;日间平均添加回收率为77.7%~114.3%,标准偏差为3.3%~13.3%,典型色谱图见图3。3.7水稻虫威的降解按照“2.3.1”所建方法对所有样品进行检测,结果表明(见表2)。茚虫威在田水、土壤和植株中的消解动态趋势呈指数回归,符合一级动力学方程。在湖南省宁乡县、江苏省镇江市、河南省新乡市三地将3%茚虫威超低容量液剂施用于水稻后,在施药后第14d时,茚虫威在田水、土壤和植株中降解率均达到了95%以上,其在