精卵孵育时间对胚胎质量及结局的影响

精卵孵育时间对胚胎质量及结局的影响

在体育外受刺激的胚胎移植（ivf-et）中，精子的情况直接关系到治疗的效果。一些报道认为短时受精有利于胚胎质量及种植潜能的提高,有些报道则未得出同样的结论。目前国内少数中心已采用短时受精法,多数中心仍延用传统过夜受精法,甚至对短时受精不了解或持有疑问。本研究对比分析了短时受精与传统受精(精卵过夜)两种精卵孵育时间的临床与实验室资料,旨在探讨短时受精对体外受精-胚胎移植治疗周期中的应用价值。1数据和方法1.1对大鼠学习周期和获卵数的影响2005年1月~2006年12月在本中心因输卵管阻塞和/或男方因素接受IVF-ET治疗的患者168例189个周期,随机分成两组:短时受精组(A组)79例96个周期,年龄25~38岁,平均(30.5±4.8)岁,平均获卵数(11.2±3.5)个;传统受精组(B组)89例93个周期,年龄23~37岁,平均(29.8±3.7)岁,平均获卵数(10.2±3.7)个,以上数据两组间经统计学分析,差异无统计学意义(P>0.05)。两组中又根据男方精液是否正常,分为精液正常组和精液异常组(中重度精液异常),精液参数按WHO标准判定。1.2方法1.2.1保乳剂、水湿地、fsh或hgm189个周期均采用长方案。于前次月经周期黄体中期给予长效促性腺激素激动剂GnRHa(Dipherline1.0mg~1.125mg,BiotechSignes,法国)皮下注射1次,进行降调节,行经后第3天测定血FSH、LH、E2水平,达降调水平后,给予FSH(Gonal-F,serono,瑞士)和/或HMG(丽珠,珠海)促排卵。根据卵泡生长情况适时调整药量。当有1个以上卵泡直径≥18mm,或2个以上卵泡直径≥17mm时,当晚9时注射HCG5000~10000U,36h后在B超引导下经阴道取卵。1.2.2液体准备手淫法取精于一次性无菌广口杯中,液化后视精液具体情况用密度梯度离心和/或上游法洗精。1.2.3精卵共孵育和发育根据卵-冠-丘复合物评估获取卵子的成熟度。取卵4~6h后,按精卵2~5万∶1比例混合法受精。短时受精精卵共孵育2h后,将卵子转移至新鲜的已平衡过的受精培养液中,传统受精组精卵共孵育过夜,第2天去掉卵子周围的颗粒细胞,清洗后转入卵裂培养基中,倒置显微镜下观察受精情况。受精卵继续培养48h后,观察胚胎发育情况,然后选择优质胚胎进行移植。1.3第三，胚胎质量评价标准根据参考文献进行。胚胎达6细胞以上,Ⅰ~Ⅱ级胚胎为优质胚胎。1.4统计方法均数比较采用t检验,率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1个周期及体质量比与优质胚胎率的比较短时受精组96个周期共获卵1078个,其受精率、多精受精率、卵裂率及优质胚胎率见附表。传统受精组93个周期共获卵949个,其受精率、多精受精率、卵裂率及优质胚胎率见附表。短时受精组与传统受精组相比较,受精率、多精受精率、卵裂率差异无统计学意义(P>0.05),而优质胚胎率,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P<0.05)。其中A1、A2组优质胚胎率显著高于B2组(P分别<0.01、<0.05)。见附表。2.2两组临床妊娠率、胚胎种植率比较短时受精组(A组)临床妊娠率、胚胎种植率显著高于传统受精组(B组,P分别<0.01、<0.05),其中A1、A2组临床妊娠率、胚胎种植率均显著高于B2组(P分别<0.05、<0.01)。流产率各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见附表。3讨论3.1耗培养液对iiif-et治疗的影响本研究结果显示,短时受精组的受精率、卵裂率、流产率与传统受精组比较,差异无统计学意义,而优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎种植率高于后者,即短时受精不但不会降低受精率、卵裂率,反而使优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎种植率升高,流产率不变。分析原因可能与以下几点有关:①传统受精组卵子与高密度精子长时间作用,精子代谢产物堆积,加之驱散的颗粒细胞及死精子等均会消耗培养液的能量,使卵子处于一个营养不良的环境中。②颗粒细胞、精子代谢产生的活性氧化物(reactiveoxygenspecies,ROS)可造成不饱和脂肪酸的过氧化,使细胞膜的流动性受到影响,从而使胞浆膜硬化,影响胚胎的分裂、发育、孵出与植入,继而影响IVF-ET治疗的结果。动物实验已证实了这一点,并通过向培养液中添加抗氧化剂来促使细胞分裂而获成功。③研究表明,卵-冠-丘复合物中的颗粒细胞可产生E2、P,并随培养时间延长浓度增高,而体外高浓度E2、P对胚胎有直接的毒性作用。④精液质量问题。在IVF-ET治疗中,胚胎质量不好时,人们总习惯去考虑卵子的质量问题,而忽略精子的因素。其实,当精液质量差时,常合并附属性腺炎症,造成白细胞增多,精子活力下降及ROS增多,从而对胚胎质量的影响更严重。故采用短时受精对男性精液异常者(中重度)提高胚胎质量、提高临床妊娠率更为有益。本研究结果也支持这一点。⑤有研究表明,来源于精子的乳酸盐和ROS不但对精卵的作用产生负面影响,同时也影响透明带(zonapellucida,ZP)的硬度和厚度。DumoulinJC等认为,精子分泌多种酶会影响ZP的厚度。而ZP被认为和胚胎的孵出以及着床有着密切关系。3.2不同精子浓度对子外受精多精萃取的影响本研究显示,短时受精未减低多精受精率,与郭江华等的报道不同,与Kattera等的报道一致。笔者认为,多精受精的主要原因与卵子不熟或过熟、卵子皮质反应异常和透明带功能缺陷即卵子的质量有关。精子与卵子相遇时,精子在顶体酶的作用下,开始受精过程。当1个精子进入卵细胞后,立即阻断Ca2+流动,并发生皮质反应、透明带反应、卵黄膜反应,从而使其他精子不能进入,上述过程瞬间即可完成。而不成熟卵子或过熟卵子卵浆基质功能差,上述反应不能如期发生,多个精子进入卵子机会多,大龄妇女卵子出现异常受精较多就是个证明。短时受精未减低多精受精的原因可能与精卵孵育的时间有关。研究表明在体外受精中,人类精子15min内即可进入丘细胞团,而本研究精卵共孵育2h,使精子有足够的时间接触并穿透卵子,故短时受精当卵子质量不佳时同样可形成多精受精。而且本研究短时受精组多精受精率不但不降低反而较传统受精组略高,只是差异无统计学意义。综上所述,笔者认为,只要精子浓度不过于高,多精受精的发生主要与卵子质量有关。如果卵子质量好受精时间延长亦不会造成多精受精。同时,多精受精也从另一个方面检测了卵子质量。同等受精条件下,正常受精卵子的质量一般好于多精受精的卵子,从而有利于淘汰一些仅从形态上无法分出优劣的胚胎。该中心有一段时间多精受精率较平时高(操作者、加精比例和方式都未改变),可利用胚胎数量较平时减少,但移植了正常受精发育而来的为数不多的几个胚胎,成功率却更高;倒是一些获卵较多、胚胎形态也很漂亮的周期,移植后成功率反倒没这么高,似乎进一步证实了多精受精更多原因是与卵子质量欠佳有关。3.3抗精子毒性研究本研究显示短时受精对精液质量异常周期(中重度精液异常)改善治疗结果更明显,原因可能为:在具有男性因素不孕的病例中,卵子通常被暴露于更高浓度的精子中,通过提高具有受精能力的正常精子的绝对数来达到较好的受精率。而研究表明,卵子长时间暴露于高浓度的精子中是有害的,特别是异常精液。因为它会产生更多的ROS,抑制受精及胚胎发育,而ROS的损害高低不仅取决于精子的浓度、质量情况,还取决于精卵共孵育的时间长短。短时受精缩短了卵子暴露于精子中的时间,故使其对卵子的损害减到较低,从而改善了治