克百威对蚯蚓的急性毒性及残留量测定

克百威对蚯蚓的急性毒性及残留量测定

克氏合金化学名称2、3-二羟基-2、2-二甲基-7-苯并含有7-氨基丙烯酸，属于氨基丙烯酸农药。国家登记可用于水稻、棉花、烟草、大豆等作物防治多种害虫,也可专门用作种子处理剂使用。同时,克百威也是丁硫克百威和丙硫克百威的一级降解产物,而丁硫克百威和丙硫克百威国家登记都可用于棉花、水稻等作物上防治多种害虫,而丁硫克百威还可用于黄瓜、番茄、十字花科蔬菜等作物上。据前人研究,克百威在旱地土壤中的半衰期为30~60d,在水田中半衰期为1~2d,并且土壤性质及环境因子都直接或间接的影响着其在土壤中的降解转化,本试验选择在同种土壤,相同条件下研究克百威的动态变化。蚯蚓是土壤中一种重要的生态环境指示生物,选择其作为非靶标生物。美国国家环保局(EPA)标准531.1及我国农业部行业标准(NY/T761—2008)规定了10种氨基甲酸酯类农药多残留的分析测定方法,此方法采用高效液相色谱柱后衍生荧光检测器检测,具有灵敏度高、选择性强、干扰小等优点,本文采用此法探索了不同质量分数克百威在土壤中的动态变化。1材料和方法1.1仪器和试剂1.1.1仪器、试剂和仪器600E型高效液相色谱、柱后衍生反应系统、试剂管理单元(美国Waters);Waters2475荧光检测器,Empower色谱工作站;500mg/6mLNH2固相萃取小柱(美国Phenomenex);KL512型氮吹仪(北京康林科技有限责任公司);旋转蒸发仪(瑞士BUCHI);恒温振荡器(常州澳华仪器有限公司);ABT220-5DM十万分之一电子天平(德国科恩)。1.1.2标准母液的配制乙腈、甲醇、二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯(广州化学试剂厂),140℃烘烤4h;液相色谱用甲醇、乙腈均为色谱纯(美国FishierScientific);片状氢氧化钠(97%)、十水硼酸钠(99.5%~105%)(英国AlfaAesar);邻苯二甲醛(OPA)、2-巯基乙醇(ME)、克百威标准品99.9%(美国Sigma公司);97.8%克百威原药(农药厂)。标准母液的配制用万分之一天平准确称取标准品10mg,移入10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成1000mg/L的母液,保存冰箱中备用。液相柱后反应试剂的配制0.05mol/L氢氧化钠的配制:称取2g片状氢氧化钠溶于1L水中,并用0.45μm滤膜过滤脱气;制备衍生用OPA/ME试剂:称取19.1g十水硼酸钠搅拌溶于1L水中备用。溶解100mgOPA于10mL甲醇中并转移至1L容量瓶中,用制备好的十水硼酸钠溶液稀释至刻度混合均匀。并用0.45μm滤膜过滤脱气后加入400μL2-巯基乙醇混合均匀,一旦ME加入后切勿再脱气,置于棕色储液瓶中避光保存。1.2方法1.2.1溶剂与流速测试方法色谱柱WatersCarbamateAnalysis3.9mm×150mmColumn,流动相水-甲醇,柱温30℃,进样量20μL,荧光检测器激发波长330nm,发射波长465nm,柱后衍生试剂0.05mol/L氢氧化钠(0.3mL/min),OPA试剂(0.3mL/min),反应器温度80℃,溶剂梯度与流速程序见表1。在此液相色谱条件下克百威的保留时间为19.765min。1.2.2新鲜土样的制备试验土壤:中国热带农业科学院中国热带植物园表层0~20cm的新鲜土样,剔除残根和石块等杂质物,过2mm筛子备用;供试蚯蚓:赤子爱胜蚓(天津蚯蚓养殖场)。1.2.3土壤的预处理供试蚯蚓的处理驯养:蚯蚓运回后放入已经调过湿度的土壤中,每天补充水分保持土壤湿度在30%左右,并添加蚯蚓饲料驯化,待死亡率稳定后方可使用。清肠:实验前挑选茁壮长度在8~10cm蚯蚓,用清水清洗干净,放入铺有湿润滤纸的盘子中,用带有气孔的铝箔封口,避光保存12h。供试土壤的处理试验前,将供试土壤于室温下放置1周,并调整土壤湿度(20%左右)保证土壤添加完农药后湿度达到30%。称取土壤326.17g(含水量20.97%)于500mL烧杯中,加药并调整土壤含水率至30%,此时土壤共重350g。先通过预备试验,设置克百威土壤中质量分数为0、7.418、14.835、22.253、29.670、44.505mg/kg,每个质量分数放入清肠后的蚯蚓10条,每个质量分数重复3次,用留有气孔的保鲜膜将烧杯蒙上,避光25℃恒温保存。分别在1、3、5、7、10、14d观察记录蚯蚓死亡情况并补充水分使土壤中水分保持一致,并用四分法取土壤样品13.000g(相当于10g干土),测定土壤中克百威的残留量,空白土壤中未检出克百威。1.2.4样品的制备及净化1)样品的提取:称量13.000g土样(根据土壤含水率计算得出相当于10g土壤干质量)于50mL离心管中,加入30mL乙腈,恒温振荡1h后离心(1200r/min,10min)取上清液。再加入20mL乙腈重复以上步骤,合并2次滤液于另一50mL离心管中。将上清液倾入250mL分液漏斗中,加入50mL25%氯化钠溶液,振荡待分层,分液。水相重新放入250mL分液漏斗中,加入30mL乙腈萃取1次,振荡静置分层,分液。将2次有机相倾入100mL烧杯中,加入25g无水硫酸钠(140℃烘烤1h),磁力搅拌20min,定性滤纸过滤,并用10mL乙腈分2次冲洗烧杯。滤液倾入1L梨形瓶内,并用少量乙腈冲洗烧杯倾于梨形瓶中,旋转蒸发近干(旋蒸参数:水浴温度35℃,压力130mPa)。用2mL甲醇-二氯甲烷(体积比1∶99)溶液,分2次将其洗出于2.5mL离心管中待净化。2)样品的净化:连接好固相萃取装置,移液管移取4mL甲醇-二氯甲烷(体积比1∶99)溶液预洗条件化;当溶剂液面达到吸附层表面时,立即加入待净化溶液,并用15mL离心管收集洗脱液;加入2mL甲醇-二氯甲烷(体积比1∶99)溶液于2.5mL离心管后过柱,并重复1次。并收集洗脱液(大约6mL)。将洗脱液置于50℃氮吹仪上蒸发近干。并用色谱纯甲醇定容2.5mL。过0.45μm滤膜,待测。1.2.5样品前处理和hplc检测用空白土壤样品进行3个质量分数的添加回收试验,使克百威在土壤中的质量分数分别为0.1、0.5、5mg/kg,按照上述方法进行样品前处理和HPLC检测。根据试验结果评价方法的准确度和精密度。2结果与分析2.1空小精度的测定按照上述色谱条件,待仪器稳定后,采用峰面积外标法进行定量。克百威样品及标准品色谱峰见图1,得到克百威的保留时间在19.705min附近。将储备液用甲醇稀释成质量分数为1、2、5、10、15mg/kg的标准溶液,分别进样测定,以峰面积y对标准液质量分数x制作标准曲线。按照上述色谱条件,每个质量分数至少进样3次,进样20μL,得到峰面积平均值,绘制标准曲线。在试验质量分数范围内,峰面积与质量分数呈正相关性,其线性方程为y=3752178.94x+596516.83,相关系数r=0.9998。2.2克百威回收率取未检出克百威的空白土壤,做加标回收试验。称取相当于10g干土的上述土壤,分别进行3个质量分数的添加回收试验,每个质量分数重复3次,结果见表2。表明低质量分数的回收率在96.7%~106.9%之间;中等质量分数的回收率在104.6%~108.4%之间;高质量分数的回收率在88.3%~91.8%之间,变异系数在1.5%~4.3%之间,空白土壤样品未检出克百威,且此色谱条件下克百威色谱峰能与其他杂质峰完全分离,因此该残留提取检测方法符合农药残留分析要求。以3倍信噪比计算得到仪器对土壤中克百威的检出限为0.01mg/kg,符合农残检测要求。2.3克百威的降解和残留物的残留情况按试验设计,克百威在土壤中的加药量分别为7.418、14.835、22.253、29.670、37.088、44.505mg/kg,加药并放入蚯蚓后间隔不同时间采样进行残留量测定,测定结果见表3。试验结果表明:加药1d后在土壤中的残留量分别为3.410、5.437、7.790、10.928、12.770、14.801mg/kg。克百威在放有蚯蚓的土壤中降解仍然较慢,在有蚯蚓存在的情况下的半衰期分别为13.72、28.29、23.18、16.74、18.99、17.03d。第14天的降解率分别为50.89%、71.47%、70.40%、58.81%、59.04%、54.21%。半衰期和降解率都呈现减小的趋势。Melo等研究表明土壤中0.2479mg/L的克百威半衰期为10.04d。据前人研究,克百威在旱地土壤中的半衰期为30~60d,在水田中半衰期为1~2d。Can等研究了甲草胺在黏壤土中的施用质量分数分别为10、100mg/kg的情况下,40周后土壤中的残留物分别为48%和37%,进一步研究得出施用质量分数超过100mg/kg时,残留物残留显著降低。Felsot等研究发现甲草胺在土壤中施用质量分数大于750mg/kg时,土壤中脱氢酶能被抑制长达21d。这种差异的主要原因在于农药在土壤中的消解方式比较复杂,其半衰期受微生物、光照、湿度、pH值、动植物代谢、农药自身性质及其在土壤中的质量分数等因素有关。而低剂量组土壤中蚯蚓死亡率较低,蚯蚓活动也可能起到一定的降解作用。2.4克百威对关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于关于农村第一所控制的培育工作所造成的毒性作用的模拟不同质量分数克百威处理土壤后,分别在1、3、5、7、10、14d观察土壤中蚯蚓的存活情况,得到不同质量分数克百威对蚯蚓死亡率的影响曲线如图2所示。结果表明试验初期(前3天)由于蚯蚓的个体差异,土壤中农药不可能完全混合均匀等原因,不同质量分数的克百威对土壤中蚯蚓的死亡率并没有明显规律。试验中观察到蚯蚓染毒后呈现腐烂、断裂,体型变粗变短,体表分泌出黄色液体,表明克百威对蚯蚓的生长、活动有显著的抑制作用,并且能对蚯蚓的皮肤结构造成损伤。这与史雅娟等的研究一致。土壤中蚯蚓死亡率在1~5d急剧上升,5d后死亡率稳定。土壤中克百威对蚯蚓第5、7、10、14天的LC50值及95%置信区间见表4。克百威在土壤中属中等毒性。3净化效果的分析在实验条件下,仪器对土壤中克百威的最小检出限为0.01mg/kg,分析方法灵敏度符合农药残留测定要求。添加回收率试验中3个添加质量分数的回收率在89.1%~106.4%之间,变异系数在1.5%~4.3%之间,分析数据准确度可靠,符合农药残留检测要求。本实验用氨基固相萃取小柱分离纯化样品,达到了较好的分离纯化效果。色谱分析用高效