山仙颗粒对黄曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型动物肝组织形态学及胎盘型谷胱甘肽-s-转移酶表达的影响

山仙颗粒对黄曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型动物肝组织形态学及胎盘型谷胱甘肽-s-转移酶表达的影响

*咸阳科技计划支持项目xk0614-2（3）。陕西中医学院2005级硕士研究生山仙颗粒作为我院院内制剂在肝癌治疗中已使用将近10年,前期的实验研究及临床应用证明其在抑制肿瘤及提高患者生存质量方面效果显著,为此本研究通过复制化学诱导的大鼠肝癌模型,探讨其对化学诱导性肝癌的影响作用,旨在研发高效、低毒或无毒的抗肝癌药物。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物清洁级SD大鼠50只,体重120g～160g,雄性,由第四军医大学实验动物中心提供。1.1.2免疫组织化学染料黄曲霉毒素B1(AFB1)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)均为美国ACROS公司产品,二甲基亚砜(DMSO)为美国Amresco公司产品;GSTpi多克隆抗体(RabbitAnti-GSTpi),工作浓度1∶80,即用型SABC免疫组化染色试剂盒,DAB显色试剂盒,均由武汉博士德生物工程有限公司生产;山仙颗粒(由西洋参、莪术、山楂、仙鹤草等组成):由陕西中医学院附属医院制剂中心提供,批号:20051104。替加氟片(FT-207):上海医药(集团)有限公司华联制药厂生产,批号:060603。1.2方法和步骤1.2.1动物模型采用段小娴等建立的单剂量黄曲霉毒素B1(AFB1)致大鼠肝癌短期实验模型(AFB1+2-AAF+2/3PH)。1.2.2山仙颗粒的灌胃协同模型采用完全随机分组法,每组10只,分别为:空白组(A组):正常饲养,不做任何处理。模型组(B组):采用“AFB1+2AAF+肝2/3切除”的肝癌模型,在此期间每日生理盐水灌胃一次。大剂量山仙颗粒组(C组):造模同上,每日按山仙颗粒10g/kg配制药液灌胃一次。小剂量山仙颗粒组(D组):造模同上,每日按山仙颗粒2.5g/kg配制药液灌胃一次。对照组(E组):造模同上,每日按替加氟200mg/kg配制药液灌胃一次。每笼五只分笼饲养。1.2.3免疫组化染色所有动物每周定期称体重一次,并随时观察进食情况、中毒症状及死亡情况。于实验第6周末各组动物称重后在10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉下剖腹取出肝脏,于10%(体积分数)福尔马林溶液中固定24h,脱水、透明、浸蜡,常规石蜡包埋,行5μm及4μm厚连续切片,分别行HE染色和免疫组化染色。肝组织形态学检查以1987年全国实验肿瘤病理专题座谈会纪要所制定标准进行判定。肝组织胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-P)免疫组化染色,以石蜡切片采用SABC法进行,以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。结果判定采用形态学分析软件JD-801D对GST-P阳性灶定量分析,即测量单位面积内阳性灶的个数(个/cm2)及单位面积内阳性灶的面积(mm2/cm2)。1.2.4统计分析各组数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,所有数据用spss13.0统计软件处理。2结果2.1对2-aaf饲料一般情况的影响A组动物一般状况良好,活动正常。造模各组动物一般情况较差,在给AFB1后各组动物均有精神差,食量减少现象,给2-AAF饲料期间,各组动物均有轻度厌食、食量减少现象,其中B组与D组较明显,体重增长减慢。C组、D组一般状况较好,体重增长较B组及E组快,其中以C组最明显。实验过程中B组2只、E组1只死于肝大部分切除术(PH)术中出血,D组1只PH后未苏醒,死亡。实验结束时,造模各组个别动物处死时有腹水及肠梗阻现象。2.2各组大鼠肝脏功能指标的比较表1A组个别轻度充血,余无异常。镜下所见:个别动物仅见部分肝窦充血。B组肝脏肿胀增大,表面不光滑,表面及切面可见较多散在直径2～4mm不等的灰白色结节,略隆起。镜下所见:肝小叶结构受到破坏,肝细胞浑浊肿胀,有水样变性及点状坏死,可见核空泡和胞腔空泡,肝窦内见卵圆细胞增生,个别区域间质细胞浸润;部分动物肝细胞变性坏死剧烈,出现嗜酸性、嗜碱性、透明细胞灶、混合肝细胞灶及大小不一的增生结节,结节外肝细胞索消失,细胞排列紊乱、拥挤,可见大量梭形、圆形、卵圆细胞增生,汇管区小胆管增生,可见少量双核、核深染、巨核细胞。C组肝脏表面欠光泽,所有动物均未见明显肝脏肿胀,表面无或少见结节,腹腔内也未见渗出液。镜下所见:性质上与B组相似,但肝细胞的变性、坏死及卵圆细胞增生均显著减轻;嗜酸、嗜碱、透明及混合细胞灶显著减少;无增生结节出现。D组肝脏略肿胀,表面欠光泽,表面及切面可见散在直径1～4mm不等的灰白色结节,微隆起。镜下所见:性质上与B组相似,肝小叶结构亦不同程度受到破坏,肝细胞的变性、坏死及卵圆细胞增生略轻,可见核空泡和胞腔空泡,部分可见嗜酸、嗜碱、透明及混合细胞灶,可见增生结节。E组肝脏外观与D组类似。镜下所见:性质上亦与B组相似,肝细胞的变性、坏死及卵圆细胞增生均较轻;嗜酸、嗜碱、透明及混合细胞灶减少;个别可见增生结节。2.3两组积mm2/cm2的比较C组动物肝组织单位面积内胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-P)灶个数(个/cm2)及灶面积(mm2/cm2)均明显较B组少(小),差异具有显著性(P均<0.01);D组及E组动物肝组织单位面积内胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-P)灶个数(个/cm2)及灶面积(mm2/cm2)虽均较B组少(小),但差异均不具有统计学意义(P均>0.05,见附表。3山仙颗粒对大鼠肝胰腺组织的复制及其限制黄曲霉毒素B1是剧毒物质,其致癌强度比奶油黄大900倍,比二甲基亚硝胺高75倍,可诱发所有动物发生肝癌。本研究B组观察到明显的肝细胞变性坏死、增生灶(嗜酸性、嗜碱性、透明、混合肝细胞)、大小不一的肝细胞增生结节及病理性核分裂相等特异性的肝细胞癌前病变,与实验肿瘤病理标准基本相符,成功地复制了化学诱导的大鼠肝癌模型。C组在癌症发生、发展过程中,与B组相比肝细胞的变性、坏死及增生均明显减轻,特异性细胞增生明显减少,未见明显病理性核分裂相及增生结节。GST-π(在鼠为P)为一组二聚体蛋白,是谷胱甘肽-S-转移酶的一种同工酶,属胚胎型同工酶,广泛分布于人体组织,与体内生物转化作用及肿瘤的发生关系密切。其在正常肝细胞中不表达,而在早期肝癌、肝癌前病变、不典型增生及原发性肝癌中高度表达,大量资料表明,GST-π(在鼠为P)在肝癌前病变组织及肝癌组织中表达明显增高,免疫组化染色可在肝脏病变发生早期检测到由GST-π(在鼠为P)阳性细胞构成的微小病灶,