籼型谷秆两用稻20001高频再生体系的研究

籼型谷秆两用稻20001高频再生体系的研究

新粮食两种水稻的产量与普通推广品种相当。由于庞大的营养成分，粗蛋白含量可以达到约8%（通常水稻杆只有约4%），可以直接用于饲料、饲料和真菌育种材料。根据丙烯酸和复合纳科学技术，我们需要改进现有的两类水稻，以满足生产的需要。水稻的转移技术和细胞无性变异技术对组织的经济培养没有必要严格限制。我们以201个母种为外植体，研究了基本培养基、琼氏质量浓度、激素、后代形成、培养基有机成分处理方法和2-4-d质量浓度对受损组织分化的影响，并研究了基于组织培养的稻田遗传改良的发展。1材料和方法1.1水稻优质品种的筛选籼型谷秆两用稻201,由福建农林大学品质生物技术实验室提供.籼稻优质品种早优718、DH7、东南950仅在研究不同品种(基因型)对幼胚愈伤组织分化率的影响时对照使用.1.2ph值的调配培养基有机成分以及激素(除6-BA、KT)等均事先调好pH值,并做超过滤处理,置于-20℃保存备用.6-BA、KT分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成母液,置于-20℃保存备用.1.2.1诱导培养基4种基本培养基见表1,均附加7.5g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖、2mg·L-12,4-D,pH5.8.1.2.2遗传培养基以NB作为继代培养基,pH5.8.在做培养基对照时,继代培养基与诱导培养基相对应.1.2.3不同质量浓度的外施总糖和总激素配比的稳定性NB+2mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA,10g·L-1琼脂,pH6.0.曾做了不同质量浓度的琼脂及不同激素配比的试验.1.2.4植物生长培养基1/2MS+0.05mg·L-1NAA+2.0mg·L-1多效唑,pH5.8.1.3愈伤组织的诱导取授粉后10-15d左右的未成熟种子,去壳后用体积分数为2%NaClO消毒5min,无菌水漂洗后,浸泡于体积分数为0.1%Vc溶液3h,取出用无菌水漂洗,经体积分数为70%乙醇表面消毒1min后,再用2%NaClO消毒28min,无菌水漂洗4-5次,用解剖针挑出幼胚并接种于诱导培养基,Parafilm封严,(26±1)℃,暗培养.每16-18d继代1次,继代2次后愈伤组织转移到分化培养基,每天光照16h,光照强度2000lx,(26±1)℃,3周后统计绿苗分化率.愈伤组织诱导率/%=出愈胚数/所接幼胚数×100.分化率/%=产生芽分化的愈伤组织数/愈伤组织总数×100.2结果与分析2.1培养基的筛选幼胚分别在4种诱导培养基上培养并继代2次后,转移至与其诱导培养基相对应的分化培养基中.不同培养基对幼胚愈伤组织的分化具有显著影响(表2),其中NB培养基较好,诱导率高达98.5%,分化率也达到66.1%,远高于其它培养基.因此应首先针对某一品种,筛选其最佳培养基,这是建立水稻高频再生系统的关键,也是水稻遗传转化的一个基础.2.2总体水分培养基的质量浓度对分离的影响较高质量浓度的琼脂可降低试管苗的玻璃化,提高水稻愈伤组织分化率及离体培养植株再生率.本试验中以分别含7.5、10.0g·L-1琼脂的分化培养基组合较好(表3),显著优于其它组合,这一点与黄亮群等报道的结果大致相符.可见在分化过程中适当提高琼脂质量浓度对提高水稻离体培养分化率具有一定的普遍性.但质量浓度太高,培养基变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中,分化率也相应降低.2.3激素质量浓度对第1代绿苗诱导分化的影响植物激素是影响愈伤组织细胞状态的重要调控因素.本试验以NB为基本培养基,分化培养基以NB(无2,4-D)配合不同质量浓度的NAA+6-BA.尽管基本培养基相同,但由于分化培养基中激素质量浓度不同,分化出的绿苗比例相差较大(表4),高的分化率可达66.1%,低的只有51.7%.本研究发现,0.05mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA更有利于提高201幼胚愈伤组织的分化率,并且对植株再生有后续效应.2.4胚性愈伤组织的分化和色整由表5可知,随着愈伤组织继代次数的增加,分化率逐渐降低.第1代愈伤组织分化率不及第2代是由于其尚未形成良好的胚性愈伤长势.继代5次后的愈伤组织分化率只有32.5%,是继代培养2次的49.2%.201愈伤组织经多次继代后虽能出绿点,但不易成苗.另外,在继代过程中,愈伤组织会产生不同程度的褐化现象,非胚性愈伤明显增多.可能由于愈伤组织被分割成小块,受到了创伤,致使细胞组织中的多酚氧化酶被激活.2.5其他因素对伤口组织的形成的影响2.5.1降低伤组织褐变死亡率NB培养基有机成分采取预先调好pH值,并进行超过滤灭菌,可显著降低继代过程中愈伤组织褐变死亡率,并能较大幅度提高201愈伤组织分化率.超过滤方法既不改变培养基中有机物质的有效成分,也避免了pH值变化过大.由表6可见,采用超过滤方法,愈伤组织褐变死亡率比高压方法降低了50%,分化频率也由47.7%提高到66.1%.2.5.2ph值继代过程中把pH由5.8调高到6.0,可稍微降低继代过程愈伤组织褐变死亡率.王彗中等也有类似报道.2.5.3胚愈伤组织的诱导以NB为诱导培养基添加2mg·L-12,4-D,可使201幼胚愈伤组织诱导率高达98.5%,但同时胚根生长过快,且在继代过程中,愈伤组织块产生一些纤细的短根,不利于继代扩繁培养.若在继代过程中降低2,4-D质量浓度至1mg·L-1可减少该现象.2.6不同品种幼胚的诱导活性王关林、陈璋等报道不同品种(基因型)对组织培养的影响很大.谷秆两用稻201稻草粗蛋白质含量比一般品种高一倍左右,其组培情况与其它籼稻品种有所差别.以NB为基本培养基,取201、早优718、DH7、东南950相同发育时期的幼胚作为接种材料,发现基因型间差异显著(表7).DH7、东南950诱导率相对较低,分别为84.5%、85.6%;早优718分化率最高,达75.3%.3分离培养基外源激素对水稻愈伤组织生长和分化的影响水稻幼胚诱导的胚性愈伤组织具有亲本遗传特性,不同基本培养基对幼胚培养力具有明显的影响.琼脂质量浓度强烈地影响着细胞分裂素和离子吸收.梅传生等、Laietal均认为较高质量浓度琼脂影响培养基的水分状况,限制其吸收水分,造成水分胁迫,内源激素含量发生变化,从而提高愈伤组织植株再生率.适当提高201分化培养基中琼脂的质量浓度能较显著提高分化率,但也不宜过高.分化培养基中的激素常以NAA配合6-BA或KT效果较好.试验中曾用KT代替6-BA,发现6-BA和KT具有类似效果,但KT浓度明显高于6-BA,其用量约在6-10mg·L-1.本试验也证实,通过调整培养基中外源激素来提高培养材料的培养力是非常有效的途径.愈伤组织经过长期继代之后,形态发生能力常常逐渐下降.水稻愈伤组织再生能力逐渐降低,因此为获得高的分化频率,必须及时将合理继代次数的愈伤组织转入分化培养基中.将继代2次的201愈伤组织转入分化培养基中能获得最高分化率.Kishor等已采用改变培养基的某些成分或添加某些物质,提高了水稻继代培养的再生能力.有机成分的超过滤、2,4-D质量浓度、pH均对愈伤组织分化有一定影响.在继代过程中,出现较多的褐变现象.褐变是诱导脱分化及植株再生的重大障碍,