聚羟基丁酸酯电纺丝膜的制备及体外降解行为

聚羟基丁酸酯电纺丝膜的制备及体外降解行为

电纺丝法制备纳米纤维自20世纪90年代初首次人工组织皮肤出现以来，该组织的发展为患有组织坏死和缺陷的患者提供了希望。支架材料是组织工程研究中的一个重点和难点,它在组织和器官的修复过程中起着至关重要的作用,不仅为细胞提供了获取营养、气体交换、生长代谢的场所,而且还为组织的形成提供力学支撑。组织工程支架的制备方法有溶剂浇铸-粒子沥滤法、冷冻干燥法、发泡法等。但是这些方法都存在一定的局限性。近几年,采用电纺丝方法制备组织工程支架的研究取得了很大进展。电纺丝方法是在电场作用下的纺丝过程或利用高压电场实现的纺丝技术,该方法最大的特点是不需要复杂的制备过程即可得到纳米纤维。电纺丝法的缺点是产出低,因此限制了它的广泛应用。为此,2003年捷克利贝雷茨技术大学与Elmarco公司合作,研制出了可批量生产纳米纤维的电纺丝机——“纳米蜘蛛”,这标志着电纺丝技术进入了一个崭新的发展阶段。电纺丝技术对材料的要求不高,一般情况下可溶、熔的聚合物都可以纺丝,例如PLA、PEO、PA等。聚羟基丁酸酯(PHB)是一种源于微生物的热塑性聚酯,它兼有天然降解材料和人工合成可降解材料的特点,对它的研究主要集中在药物缓释和组织工程方面。近来,有学者采用电纺丝法制备PHB超细纤维,用作组织工程支架材料,但是对这种电纺丝支架的制备工艺、降解性能和生物相容性的研究还很有限。本研究采用电纺丝方法制备了聚羟基丁酸酯电纺丝膜支架,探讨了各种操作参数对纤维形态的影响,并进一步研究了它的降解性能和生物相容性。1材料和方法1.1不锈钢接收屏电纺丝设备主要包括三个部分:高压电源(DW-P303-1AC,Dongwen,China),恒压注射泵(TS2-60,LongerCo.,China)和不锈钢金属接收屏(45mm×120mm)。聚羟基丁酸酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)、PHB、Mw≈30000g/mol,3HB含量为90.45mol%),由天津国韵生物技术有限公司提供。二氯甲烷(DM,分析纯)、1,4-二氧六环(DO,分析纯)购于北京世纪红星化工有限公司。1.2phb电纺丝膜的制备将一定量的PHB粒料溶于DM中,室温下磁力搅拌24h,得到不同浓度的溶液(2wt%、3wt%、4wt%),作为电纺丝液。取5mL该溶液注入10mL连接4号医用针头的注射器中,并磨平针头以防止纺丝过程中的尖端放电效应。针头末端与直流高压电源连接。用导线将金属接收屏与地相接,使其与针头间形成电场。控制恒压泵流速(0.5mL/h、1mL/h、2mL/h、3mL/h、4mL/h)、接收距离(9cm、12cm、18cm、23cm)以及电压(12kV)。制备得到厚度约为0.15mm的PHB电纺丝膜,作为组织工程支架。制备PHB浇铸膜,并控制浇铸膜的厚度与电纺丝膜相同,用以研究支架的各种物理化学性能。1.3样条的降解考察PHB电纺丝膜及浇铸膜在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的体外降解行为。将电纺丝膜和浇铸膜剪成2cm×1cm的矩形样条,在50℃条件下真空干燥24h后,精确称量所有的样条。具体的降解过程如下:将样条放入15mL的带盖玻璃瓶中,向瓶中加入10mLPBS缓冲溶液(pH7.4,0.2M)并完全浸没样条,然后置于37℃的恒温烘箱中进行降解。待样条降解一定的周期(0d、7d、14d、21d、28d、42d)后,将其取出,用去离子水反复冲洗,干燥并称重。每隔7d更换一次新鲜的PBS溶液。每组试验做3组平行试验,取平均值。样条的质量损失率(WL)按如下方程来计算:WL=(M0−MtM0)×100%WL=(Μ0-ΜtΜ0)×100%式中,M0是样条初始质量,Mt是降解周期t(t=0d、7d、14d、21d、28d、42d)后样条的质量。1.4w、细胞培养为了分析PHB支架的生物相容性,将小鼠成纤维细胞(L929,北京积水潭医院)接种于材料表面,观察细胞的形态。细胞(L929)复苏2w,细胞传代48~72h生长旺盛时进行细胞培养。首先用紫外光消毒样品,然后在24孔培养板中以细胞密度为4×104/孔接种在材料上。由于PHB支架的疏水性较强,因此在接种细胞时,先加少量细胞悬液于膜片上,置于37℃、5%CO2的培养箱中贴壁1~2h。待细胞悬液基本渗入膜内后,再补加培养基(1640,Gibco,USA)。继续培养4d后,用3%的戊二醛溶液固定细胞0.5h,然后进行SEM观察。1.5纤维直径和支架的结晶性对PHB支架进行SEM(CambrigeS250MK3,UK)表征,根据SEM照片,测量纤维直径。用XRD(D/max2500VB2+PC,RigakuCo.,Japan)分析支架的结晶性。用万能材料试验机(Instron1185,USA)测试支架的力学性能,形变速率是100mm/min。2结果与讨论2.1操作参数对phb纤维形态的影响2.1.1溶液浓度对电纺丝过程的影响在电纺丝过程中,溶液浓度对纤维形态起着至关重要的作用。从图1中可以看出,当溶液浓度为2wt%时PHB呈珠线体,大于2wt%时珠线体消失,得到了直径较为均匀的纤维。随着溶液浓度的增加,纤维的平均直径也由2.02μm增加到2.23μm。在电纺丝过程中,聚合物射流经历三个不稳定性,雷利不稳定性(RayleighInstability),轴对称不稳定性(AxisymmetricalInstability)和弯曲不稳定性(BendingInstability)。当溶液浓度较低时,溶液射流受到的雷利不稳定性或轴对称不稳定性增大,易形成如图1a中所示的珠线体。随着溶液浓度的增大,珠线体的形成因素受到抑制,从而得到了形态良好的纤维。对于相对分子质量、溶剂相同的聚合物溶液体系来说,其可纺浓度范围是有限的,超出这个范围,则电纺丝过程难以控制。因此,选择一个合适的溶液浓度对于制备电纺丝膜来说很重要。另外,注射泵流速(纺丝溶液的补给速率)对纤维直径的影响同溶液浓度一致,即纤维直径随注射泵流速的增加而增大(见图2)。2.1.2弯曲不稳定性作用于纤维图3是接收距离(即喷丝口与接收屏间的垂直距离)对纤维直径的影响。由图3可知,随着接收距离的增加,纤维直径也随之增大。在电纺丝过程中,弯曲不稳定性对超细纤维的形成起着决定性的作用。具体地说,当接收距离较近时,射流受到的弯曲不稳定性增强,纤维的直径变小;当接收距离较大时,射流受到的弯曲不稳定性减弱,纤维的直径增大。另外,当电压一定时,电场强度与接收距离成反比,因此纤维直径随电场强度变化的趋势与接收距离的规律相反。2.1.3phb/dm+do体系与传统溶液纺丝相似,溶剂的性质对电纺丝纤维的形态、结构与性能有很大影响。如图4所示,对于PHB/DM体系,纤维直径约0.89μm,纤维表面粗糙;对于PHB/(DM+DO)体系,直径约1.4μm,纤维表面比较平滑且纤维界面间形成部分粘连。对于这一现象认为:(1)DO的表面张力较大,能够保证纤维表面的平滑;DO的沸点较高难以被完全除去,少量DO的存在促进了聚合物分子链的松弛,从而导致了纤维界面间的粘连。因此溶剂体系对纤维形态的影响主要取决于溶剂的物理性质及其与聚合物分子间的相互作用。2.2晶粒大小对结晶度的影响图5是XRD谱图,其中曲线a、b分别对应PHB的电纺丝膜和浇铸膜。相对于浇铸膜,电纺丝膜晶面(020)的衍射峰强度更大,半峰宽更窄;相反地,(002)晶面上的衍射峰却消失了。另外,由谢勒公式计算得出的电纺丝膜和浇铸膜在垂直于(020)晶面的晶粒大小分别为22.3nm、18.1nm,即相对于浇铸膜,电纺丝膜的晶粒较大。这些数据都说明PHB电纺丝膜在(020)晶面法线方向上的结晶速率远大于其他晶面,因此相应的衍射峰也变得异常尖锐。研究发现,如果聚合物纤维的拉伸速率与分子链松弛时间的乘积大于0.5,那么聚合物分子链可具有高度的取向。在电纺丝过程中,表面带电的射流在弯曲不稳定性的作用下其拉伸速率达到了105m/s,这个速率与聚合物链松弛时间(0.1~0.01s)的乘积远远大于0.5,具备了分子链取向和结晶的理论条件。因此,可以确定PHB电纺丝膜的结晶度大于浇铸膜。PHB电纺丝膜的这种取向结晶必将影响它的力学性能。2.3孔隙率对电纺丝膜力学性能的影响为了验证上面的推测,对PHB电纺丝膜和浇铸膜进行了力学拉伸测试。如图6所示,相对于浇铸膜,PHB电纺丝膜的应力、应变较低。分析原因主要有以下两点:(1)较大的孔隙率降低了电纺丝膜的抗拉伸强度,在拉伸过程中,膜内部大量孔洞的存在减小了样条的承载面积,从而导致膜的拉伸强度下降;(2)电纺丝膜在凝固析出过程中各晶面法线上的结晶速率不同,如上所述在(020)晶面法线方向上形成较大的晶粒,它的力学表现是样条断裂伸长率的下降。总之,较大孔隙率和较高结晶度共同作用的结果,导致了电纺丝膜力学性能的下降。组织工程支架要具备一定的力学强度,如何提高电纺丝膜的力学强度有待进一步研究。2.4phb膜的降解聚合物的降解过程受到很多因素的影响,包括聚合物性质如成分、分子间相互作用、亲/疏水性,结构参数如外形、结晶度、取向程度、表面结构等。电纺丝膜的特殊结构不仅影响了它的结晶性及力学性能,而且在很大程度上也决定了其降解性能。如图7所示,曲线a、b分别描绘了PHB电纺丝膜和浇铸膜的质量损失率(WL)同降解周期的关系。如图所示,两条曲线的变化趋势相同,但降解速率不同:样品降解42d后,电纺丝膜的WL是浇铸膜的3倍。目前PHB可能的降解机制主要有两个:分子链无规断裂机制和表面水解机制。Majid等研究了PHB浇铸膜在有水和无水条件下的降解动力学,指出PHB在水溶液中的降解机制主要是表面水解。对于PHB电纺丝膜而言,其内部含有大量的孔洞,这有利于PBS缓冲溶液的渗入和降解小分子的溶出;较大的比表面积有利于PHB纤维的表面水解;不对称的结晶结构进一步促进了表面水解的发生。因此,PHB电纺丝膜的加速降解归因于它的特殊的表面结构。对于组织工程支架而言,可控的降解速率是很重要的。因此,可以设想通过控制电纺丝膜的孔隙率、纤维直径等能够在一定范围内控制膜的降解速率。2.5phb电纺丝膜的微观结构选用小鼠成纤维细胞(L929)对PHB支架的生物相容性进行了研究。如图8所示,细胞在支架表面的形态各异,有的呈凸起状(见图8(a)),有的呈凹陷状(见图8(b)),有的则半嵌入支架中(见图8(c))。细胞的这些形态与PHB电纺丝膜的微观结构息息相关。PHB电纺丝膜是由纤维无规堆积而成,单个纤维的表面含有很多凹槽,表面粗超度较大,这有利于细胞与纤维表面的粘附,同时孔隙的存在利于细胞的新陈代谢、增殖分裂以及细胞间的信息传递。对PHB支架的细胞毒研究结果也表明该材料对细胞无毒。因此PHB支架适宜细胞的生长,是一种具有较好生物相容性的支架材料。3phb支架的力学性能采用电纺丝法成功制备了聚羟基丁酸酯(PHB)支架,系统研究了支架的制备及性能。结果表明,纺丝液浓度、注射泵流速