生物化学-酶化学课件

酶

化

学

(ChemistryofEnzyme)本章重点及难点重点：了解酶作为生物催化剂的特点、国际命名；了解酶催化作用机理；掌握酶促反响动力学中米氏方程及Km的意义、应用，掌握影响酶促反响动力学的因素及与影响酶催化高效性的因素之间的区别。掌握别构酶的特点及核酶、同工酶、诱导酶等的概念。难点：酶催化作用机理、各因素对酶促反响速度的影响及酶促反响动力学的应用。第一节通论一、酶学研究历史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。二、什么是酶？

酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。

三、酶与一般催化剂的共性及特性1、共性〔1〕不发生质、量的变化，但能改变反响速度〔2〕不改变反响的平衡点，但能缩短反响时。〔3〕可降低反响活化能〔4〕只能催化热力学允许的反响2、个性〔1〕极高的催化效率〔2〕高度专一性〔3〕易失活〔4〕酶活性可调控〔5〕催化作用与结构有关

酶专一性类型1.结构专一性酶对所催化的分子〔底物，Substrate〕化学结构的特殊要求和选择类别：绝对专一性和相对专一性2.立体异构专一性酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求类别：旋光异构专一性和几何异构专一性四、酶作用专一性的假说(1)、锁钥学说〔模板学说〕

(2)、多位点亲和理论(3)、诱导契合学说

(3)、诱导契合学说五、酶的命名和分类1.命名：习惯命名；系统命名2.国际系统分类法及编号*国际生物化学会酶学委员会〔EnzymeCommsion〕将酶分成六大类：1.氧化复原酶类，2.转移酶类，3.水解酶类，4.裂解酶类，5.异构酶类，6.合成酶类

*每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶EC1.1.1.27大类亚类亚亚类序号

第二节

酶的分子结构与功能

酶简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。

结合酶酶蛋白辅助因子〔简单蛋白质〕〔结合蛋白质〕〔apoenzyme〕〔cofacter)辅酶〔coenzyme)辅基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme〕=酶蛋白+辅助因子一、酶的组成*各局部成分在催化反响中的作用酶蛋白决定反响的专一性辅助因子决定反响的种类与性质金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丧失。金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。辅助因子分类〔按其与酶蛋白结合的紧密程度〕

辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。或称活性部位，酶分子中直接和底物结合并起催化反响的空间局限〔部位〕。1.酶的活性中心〔结合部位和催化部位〕二、酶分子的结构特征

结合部位酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位，结合部位决定酶的专一性。催化部位酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位，催化部位决定酶所催化反响的性质。

活性中心的特点活性部位只占酶整个分子很小局部。通常只有几个aa残基组成。酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级结构中形成的，酶的活性中心的aa残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠近。酶与底物的结合是活性局部与底物的形状发生诱导锲合的过程。酶的活性部位位于酶分子外表的一个裂缝内，底物分子就结合到这个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合通过次级键。AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser1952.必需基团指酶表现催化活性不可缺少的基团，指在活性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。

底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心

三、与酶的高效率有关的主要因素〔策略〕

1、邻近与定向效应2、诱导契合与底物扭曲变形3、共价催化4、酸碱催化5、微环境影响酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团胰凝乳蛋白酶反响的详细机制〔1〕结合底物His57质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物胰凝乳蛋白酶反响的详细机制〔2〕羰基产物释放四面体中间物的瓦解水亲核攻击羧基产物释放第三节酶促反响的动力学本节需要解决的问题底物浓度与酶促反响速度的影响酶浓度对酶促反响速度的影响pH对酶促反响速度的影响温度对酶促反响速度的影响激活剂对酶促反响速度的影响抑制剂对酶促反响速度的影响一、底物浓度对反响速度的影响

〔一〕、曲线的根本含义单底物、单产物反响酶促反响速度一般在规定的反响条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反响速度取其初速度，即底物的消耗量很小〔一般在5﹪以内〕时的反响速度底物浓度远远大于酶浓度在其他因素不变的情况下，底物浓度对反响速度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时反响速度与底物浓度成正比；反响为一级反响。[S]VVmax随着底物浓度的增高反响速度不再成正比例加速；反响为混合级反响。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反响速度不再增加，达最大速度；反响为零级反响。[S]VVmax〔二〕米氏方程式中间产物

1.快速平衡理论与稳态平衡理论E+Sk1k2k3ESE+P快速平衡理论1913年Michaelis和Meuten提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定ES分解成产物的逆反响可忽略不计，因此在“快速平衡〞理论的根底上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反响速率之间的定量关系，称为米氏方程。稳态平衡理论1925年Briggs和Haldane提出，反响进行一段时间后，ES浓度增加到一定值时，ES也在不断分解，只有当ES的生成速度与分解速度相等时，ES的浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。2.什么是米氏方程式？1913年Michaelis和Menten在快速平衡理论的根底上提出反响速度与底物浓度关系的数学方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)，1925年Briggs和Haldane在稳态平衡理论的根底上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程[S]：底物浓度V：反响速度Vmax：最大反响速度Ｋm：米氏常数米氏方程的推导令：将〔4〕代入〔3〕，那么：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由[ES]决定，即，所以(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于稳态时：当[Et]=[ES]时，(4)所以

当反响速度为最大反响速度一半时Km值的推导Km＝[S]*Km值等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2Km的意义Km值①Km等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度。②意义：a)Km是酶的特征性常数之一；b)Km可表示酶对底物的亲和力；c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。Vmax的意义定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反响速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度，可从Vmax计算酶的转换数，即动力学常数K3。Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km3.米氏常数Km的测定二、酶浓度对酶促反响速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反响速度与酶浓度成正比关系式为：V=K3[E]三、温度对酶促反响速度的影响

(1)、一方面是温度升高,酶促反响速度加快；(2)、另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；(3)、因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,酶促反响速度最大。四、pH对酶促反响速度的影响五、激活剂对酶作用的影响

金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：Cl-、Br-有机分子复原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA定义：但凡能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。类别：六、抑制剂对酶反响的影响酶的抑制作用有些物质能与酶分子上某些必须基团结合〔作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失。失活作用凡可使酶变性而引起酶活力丧失的作用。抑制剂能够引起酶的抑制作用的化合物。抑制剂的特点a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。两者的区别：

抑制剂对酶的抑制作用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶的活性丧失活降低，而蛋白质变性剂可使所有的酶变性失活。在抑制剂与酶的结合而导致的抑制作用中，抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态相似〔结构上〕。另一方面能够与酶的活性中心以非共价键或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂那么作用方式较多。抑制作用的类型

非专一性不可逆抑制不可逆抑制作用专一性不可逆抑制抑制作用竞争性抑制可逆抑制作用非竞争性抑制反竞争性抑制(1)不可逆抑制作用抑制剂与酶反响中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。非专一性不可逆抑制剂

抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：专一性不可逆抑制剂

这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX〔2〕可逆性抑制作用抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制

竞争性可逆抑制

①某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。②竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。③动力学：Vmax不变；Km值增加，酶与底物的亲和力降低。磺胺类药物的设计

竞争性抑制曲线

磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶＋对氨基苯甲酸＋谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸非竞争性可逆抑制①定义：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。②动力学：Vmax减小，Km不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，EDTA等

非竞争性抑制曲线①定义：抑制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引、起酶活性下降。②动力学：km减少，酶对底物亲和力增加，最大反响速度减少，也无法通过改变底物浓度而改变反响抑制剂的影响。

举例：多底物反响中反竞争性抑制作用反竞争性抑制曲线

〔一〕、酶别离纯化的一般原那么－与蛋白质相似

1、材料的预处理；2、破碎细胞；3、蛋白质的粗提〔与杂质分开〕；4、将蛋白质沉淀出来〔等电点、盐析法、有机溶剂法〕；5、粗制品纯化〔凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法〕。七、酶的别离纯化和活力测定1.酶活力〔enzymeactivity,也称酶活性〕〔二〕、酶的活力与测定酶催化一定化学反响的能力，用在一定条件下酶所催化反响的反响速度来表示。酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位〔unit,U〕，就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所有的测定方法有关。

习惯上沿用的单位如:乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+

乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。2.酶活力单位的表示方法

国际单位(IU)：1961年在最适条件下，每分钟催化1μmol底物的减少或产物的生产所需的酶量为一个国际单位。催量单位(katal)：1972年指在最适条件下，每秒钟使１mol底物转化为产物所需的酶量。1Kat＝6×107IU，可以以纳Kat、微Kat来进行换算。3．测定酶活力时应注意几点〔1〕应测反响的初速度〔2〕酶的反响速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。〔3〕测酶活力时应使反响温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。〔4〕测定酶反响速度时，应使[S]>>[E]。产物浓度[P](t)4.酶活力的测定方法

〔1〕分光光度法〔spectrophotometry〕该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光局部光吸收不同。如氧化复原酶类。简便、迅速、准确。一个样品可屡次测定，有利于动力学研究。可检测到10-9mol/L水平的变化。优点：习惯上沿用的单位如:乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+

乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。〔2〕荧光法〔fluorometry〕该法要求酶反响的底物或产物有荧光变化。主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADHNADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。例：乙醇+NAD+乙醛+NADH+H+

乙醇脱氢酶〔3〕酶偶联分析法(enzymecouplingassay)第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反响。P1无光吸收或荧光变化，偶联后,P2有光吸收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP己糖激酶葡糖-6-磷酸+NADP葡萄糖酸-6-磷酸+NADPH+H+

G-6-P脱氢酶5.酶的比活力〔specificactivity，也称比活性〕比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。

比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。

比活力＝总活力单位数÷蛋白质总毫克数＝活力单位数÷mg蛋白质(杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白〕

比活力是酶纯度衡量的重要指标之一终点法〔终止法〕：测定完成一定量反响所需要的时间，一般测产物的生成量比较好。动力学方法〔连续法〕：测定一定时间内所起的化学变化量，灵敏度较高。6、测定酶活力的一般方法

1.纯化倍数2.比活力

3.回收率

〔三〕、如何衡量纯化的酶的质量

第四节

酶的调节

一、酶原与酶原的激活

酶原有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。酶原激活的机理酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程酶原激活的生理意义防止细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。二、变构酶变构酶〔别构酶〕有些酶可以与某些化合物〔称为变构剂〕发生非共价结合，引起酶分子构象的改变，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为~。结构特点活性中心〔结合部位和催化部位〕和变构中心〔特殊的调控部位〕。注意：变构中心不是酶活性中心的组成局部。酶的别构〔变构〕效应示意图效应剂别构中心活性中心调节物：也称效应物，一般指的是酶的底物或底物类似物或代谢的终产物。别构效应：调节物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反响速度代谢过程，这种效应称为别构效应。

正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。负效应物:指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。〔1〕常为多个亚基构成的寡聚体；〔2〕具有别构效应；〔3〕动力学曲线不符合米曼方程双曲线；〔4〕酶分子上含两个中心或部位：活性中心〔活性部位〕和别构中心〔别构部位〕。1963年，Monod等首次提出别构酶的概念。他认为别构酶应具备以下特征：

同促效应：配体相同。当一个效应物与酶结合后，

影响另一相同的效应物与酶的结合。

异促效应：配体不同。当一个效应物与酶结合后，

影响另一不同效应物与酶另一局部结合。

别构效应的种类1、根据配体性质分2、协同效应

一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。

正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，有利于后续底物分子或调节物分子的结合。负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，不利于后续底物分子或调节物分子的结合。别构酶调节的两种模型

SSSSSSSSSSSSSS亚基全部处于R型亚基全部处于T型依次序变化序变模型〔KNW〕：1966年由Koshland、Nemethy和Filmer