柚皮提取物的分离纯化及其抑菌作用的初步研究

柚皮提取物的分离纯化及其抑菌作用的初步研究

结果表明，葡萄柚提取物不仅对金黄色细菌、杆菌和伤寒杆菌具有较高的抗菌活性，而且对抗真菌药物具有强烈的抗菌活性。Negi等人也证实,葡萄柚中正己烷提取物的醇溶组分有较强的抑菌活性,且对革兰氏阳性菌更为有效。但是对于柚皮提取物抑菌的研究,国内仍处于探索阶段,与之相关的文献报道和研究很少,仅林捷等研究了柚皮的乙酸乙酯提取物的抑菌作用。证实了其对苏云金芽孢杆菌、卵黄色八叠球菌以及酸泡菜中分离的混合细菌有很强的抑制作用。研究中通过采用乙醇提取柚皮中的活性成分(主要为柚皮黄酮),选择了几种细菌、霉菌,对柚皮提取物的抑菌作用进行了初步的研究,旨在为我国柚子的综合开发利用提供理论依据。1材料和方法1.1主要真菌柚皮提取物:自制,总黄酮含量为10.9%。葡萄柚原液:湖北庆生堂医药集团有限公司。菌种:供试大肠杆菌(Escherichiacoli)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰绿青霉(Penicilliumglaucum)均由我校畜牧兽医学院提供。培养基:牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖马铃薯(PDA)培养基。1.2方法1.2.1提取液浓缩液的制备称取柚皮干粉200g,以60%的酒精浸提干粉2次,第1次以20∶1的料液比浸提,第2次以10∶1的料液比浸提,抽滤得到柚皮提取液。真空浓缩,得到浓缩液。将浓缩的乙醇提取液上NKA9大孔树脂柱,用蒸馏水洗脱,至洗脱液中不在含糖,然后用60%的酒精进行洗脱,将洗脱液重复上柱,收集60%乙醇洗脱液,回收溶剂,冷冻干燥后制得样品。置于干燥器中备用。经芦丁标准比色法测定,提取物中总黄酮含量为10.9%。1.2.2关于橙色提取物的抗菌活性研究1.2.2.柚子皮提取物的制备菌悬液的制备:取大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面,37℃培养约24h,用接种环从斜面上挑菌到100mL无菌水中制成菌悬液,稀释10倍,并通过混平皿计数,确定菌液的稀释度,使最后的菌悬液所含活菌量在1×106~1×107?cfu/mL。接种培养:无菌操作下,用取液器吸取相同体积的菌液和不同浓度的柚皮提取物到灭菌小离心管中,充分混匀后,迅速注入200μL到灭菌平皿中,每种浓度的柚皮提取物做2个平行,以菌液和同体积的无菌水的混合液注200μL作空白,也可直接注入菌液100μL作空白;倒入已灭菌置45℃下恒温的培养基10~12mL(每次实验平皿中培养基倒入量应保持一致),晃动平皿使混合液充分散开,均匀分布到平皿上,待培养基凝固后,置37℃培养箱中培养1~2d观察菌落生长情况,并对菌落计数。以下式计算抑菌率:抑菌率(%)=空白皿菌落数-样品皿菌落数空白皿菌落数×100%1.2.2.设置滤纸片、培养基菌悬液及柚皮提取物的制备:直接用接种环挑取已经活化好的斜面菌种到无菌水中制成菌悬液(含活菌量较大,以便抑菌实验中可以致密接种)。用无菌水倍比稀释配制5%、2.5%、1%、0.5%四个浓度的柚皮提取物,用无菌水稀释配制1∶50的葡萄柚原液。滤纸片的制备及处理:用灭菌镊子取烘干后的灭菌滤纸片到配制好的柚皮提取物中浸2h,置30℃烘箱中烘干备用。以无菌水浸过的滤纸片做空白。接种培养:无菌操作下,倒入灭菌过的培养基制成平板,将菌悬液注100μL到平板上,用涂布棒涂抹均匀后放置约30min后以无菌操作将含柚皮提取物的5.5mm滤纸片贴到培养基上,每个平皿贴全所有浓度及空白的滤纸片,共计6张,每种菌做2个平行;置37℃培养箱中培养1~2d观察测量抑菌圈直径大小。1.2.2.ph值的确定不同pH值培养基的准备:配制普通牛肉膏蛋白胨培养基,分为3份,调节pH值分别为5、6、7,121℃灭菌20min备用。菌悬液制备及接种培养:同MIC法,所用柚皮提取物浓度为1%。1.2.2.菌悬液的制备样品的处理及制备菌悬液:取1%的柚皮提取物,用4支小离心管分装,1支于室温(20~25℃)下放置,另外3支分别置50℃、80℃、100℃的不同烘箱中处理2h,取出备用。以无菌水稀释已活化好的大肠杆菌和沙门氏菌种制备含活菌量1×106~1×107?cfu/mL的菌悬液备用。接种培养:同1.2.2.3节。1.2.2.生长平板的制备霉菌菌种的活化:制备PSA培养基斜面,取黑曲霉、米曲霉、青霉菌种接种到斜面上活化24h,取活化菌再次接种到斜面上进行2次活化48h,备用。接种培养:无菌操作下,用取样器吸取5%柚皮提取物到6个灭菌平皿中,每种菌做两个平行,另取6个灭菌平皿作空白,倒入已灭菌置45℃下恒温的PSA培养基约15mL(每次实验平皿中培养基倒入量应保持一致),充分混匀制成平板。用接种针把少量的三种霉菌接种在平板表面上,成等边3角形的3点接种,在温度28±1℃的培养箱中培养2~3d,使各自独立形成菌落,分别于第2天和第3天观察记录菌落生长情况,并测量菌落直径大小。抑菌率通过以下公式计算:抑菌率/%=空白菌落直径-样品菌落直径空白菌落直径×1002结果与分析2.1柚皮提取物对细菌的抑制作用2.1.1沙门氏菌和细菌mic的mic测定用稀释好的0.25%、0.5%、1%、2%、2.5%等5个浓度的柚皮提取物测定对大肠杆菌,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC,并计算抑菌率,结果见表1。由表1可见,柚皮提取物对大肠杆菌,金葡球菌和沙门氏菌都具有一定的抑菌作用。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强,其MIC均为1%,但对沙门氏菌的抑制作用较弱,当浓度达到2.5%时,抑制率仅为65.2%。2.1.2spe用量对菌株抑菌圈的影响用稀释好的0.5%、1%、2.5%、2.5%和1∶50的葡萄柚原液5种不同浓度的柚皮提取物的抑菌圈直径大小,比较柚皮提取物的抑菌效果,结果见表2。抗菌素抑菌圈试验结果的判定标准是:抑菌圈直径>15mm时为高度敏感、10~15mm时为中度敏感,7~9mm时为低度敏感、无抑菌圈者为不敏感。从表2可以看出,葡萄柚对供试3种细菌均有很强的抑制效果,2%的葡萄柚原液抑菌圈均大于15mm,属高度敏感,而柚皮提取物对所试3种细菌均有一定的抑制效果,当提取物浓度为1%时即有一定的抑菌圈,而且随着提取物浓度的增加,其抑菌效果也成上升趋势,当浓度达5%时均表现为中度敏感,但相比较而言,SPE对大肠杆菌和金葡球菌的抑制作用强于沙门氏菌,这与MIC的实验结果一致。但是其量效关系和MIC实验相比较,不是很明显。这可能是与提取物的扩散性有关,当提取液在滤纸片吸附后,不能很好的扩散到培养基中去,影响了抑菌效果。2.1.3ph值对抑菌效果的影响分别调节牛肉膏蛋白胨培养基pH值为5、6、7.2,用平板稀释法测定1.0%柚皮提取物在不同pH的环境中对供试3种细菌的抑制效果,结果见图1。图1表明,pH对柚皮提取物抑菌有较明显的影响,偏酸性的pH值更有利于抑菌。在pH5~6范围内,柚皮提取物抑菌效果更好,这可能是因为柚皮黄酮是提取物中起抑菌作用的主要物质之一,而柚皮黄酮在酸性条件下比较稳定。同时,当介质pH分别为5和6时,空白对照中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的菌落数也明显少于pH7.2时,这是因为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最适生长条件是pH7.0~7.5,在酸性条件下金黄色葡萄球菌和沙门氏菌本身的生长也受到了抑制,而大肠杆菌的最适生长条件是pH6.0~7.0,在pH5时,其本身的生长也受到了一定的抑制。2.1.4抑菌效果的测定分别用不同温度下处理柚皮提取物,用平板稀释法测定不同温度处理后的1.0%柚皮提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果。结果见图2。图2表明,经过50℃处理,样品的抑菌活性基本未变,但经过80℃和100℃处理后样品的抑菌活性已经大幅度降低,这可能是经过高温加热后,提取物中抑菌物质的化学结构发生了变化,从而降低了抑菌效果。2.2柚子皮提取物对真菌生长的影响制备含柚皮提取物的PSA培养基平板,将黑曲霉、青霉和米曲霉3点接种到平板上,培养观察测定菌落直径大小,以初步评价柚皮提取物对霉菌的作用效果,结果见表6。表3表明,柚皮提取物对霉菌有一定的抑制作用,对黑曲霉的抑制作用最明显,2%的柚皮提取物抑制率为60.5%;对青霉和米曲霉的抑制作用相对较弱5%的柚皮提取物对青霉和米曲霉抑制率分别为59.5%和34.3%。3抑菌活性的测定Negi等研究发现,葡萄柚的正己烷提取物的醇溶组分有较强的抑菌活性,混合物的抑菌活性强于从中所分离出的纯柚皮苷,说明是多种组分共同发挥抑菌作用的。林捷等用不同溶剂提取梁平柚皮并对提取物抑菌作用进行了研究,结果表明柚皮经乙酸乙酯浸提而得的提取物抑菌效果最好,而乙醇、石油醚、丙酮、乙醚浸提的样品抑菌效果并不理想。且乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用很微弱,而对苏云金芽孢杆菌,卵黄色八叠球菌等革兰氏阳性菌具有很强的抑制作用。因此他认为,提取