果胶酶活力测定与释酶条件的研究

果胶酶活力测定与释酶条件的研究

果胶酶是世界上四大酶之一。这是一种含有多种成分的复合酶。一般来说，果胶酶是指分解各种果胶的酶的总称，包括半乳液酶（pg）、果胶分解酶（pl）和果皮酯酶（pe）等主要成分。储存过程中起作用的果胶酶主要是pg，因此pg的生命力用于表达果胶酶的活力。果胶酶发酵工艺研究和双水相萃取工艺研究中,果胶酶活性测定是必不可少的,而且测定的准确与否直接影响着最佳工艺条件的确定,最终影响果胶酶的产率和成本,但是,在果胶酶活性的测定过程中发现:同样的样品采用不同的稀释倍数测到的酶活力相差很大,数值变化规律性很差,不少资料也报道了果胶酶活性在测定中的不稳定性,这些都与理论上的酶活力大小和测定时稀释倍数无关的结论相矛盾。笔者就果胶酶稀释倍数与其活力测定值之间的关系进行了研究,目的在于寻找合适的果胶酶稀释倍数,得到比较稳定的测定结果。其研究结果可直接用于果胶酶的发酵工艺和双水相萃取工艺研究中。1材料和方法1.1硫代硫酸钠、碳酸、柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸、两钾的含量果胶粉,Sigma公司生产。液体果胶酶、硫代硫酸钠、碳酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、碘、碘化钾、硫酸、可溶性淀粉、PEG600、PEG2000、磷酸二氢钾,均为分析纯,市售。1.2主要设备和设备1.2.1主要设备如表1所示。1.2.2其他设备比色管、容量瓶、碘量瓶、滴定管、移液管等等。1.3缓冲液ph的影响准确吸取浓缩酶液1.00ml于一定体积的容量瓶中,用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)稀释定容。酶液浓度应控制在消耗0.05mol/lNa2S2O3标准溶液(A-B)之差在0.5-1.0ml范围内,必要时可先做预备试验。1.4酶活性测定1.4.1温度测定方法⑴果胶粉10g/l水溶液;⑵Na2S2O3标准溶液,C(Na2S2O3)=0.05mol/l;⑶Na2CO3溶液,C(1/2Na2CO3)=1mol/l;⑷碘标准溶液C(1/2I2)=0.1mol/l;⑸硫酸溶液C(1/2H2SO4)=2mol/l;⑹可溶性淀粉指示液(10g/l);⑺柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)。1.4.2测量果胶酶水解果胶,生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸具有还原性糖醛基,可用次碘酸钠法定量测定,以此来表示果胶酶的活性。(1)将a和b插入比色管中10个点g/l果胶溶液5ml。在50℃±0.2℃水浴中预热5-10min。(2)酸-柠柠檬酸钠缓冲液的合成ml。乙管(样品)中加稀释酶液1ml,柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)4ml,立刻摇匀,计时,在此温度下准确反应0.5h,立即取出,加热煮沸5min终止反应,冷却。(3)mol/lna2co3溶液ml放入碘量瓶中,准确加入1mol/lNa2CO3溶液1ml,0.1mol/l碘液5ml摇匀,于暗处放置20min。(4)s13标准溶液体积测定mol/lH2SO4溶液2ml,用0.05mol/lNa2S2O3标准溶液滴定至浅黄色,加淀粉指示液1ml,继续滴定至蓝色刚好消失为其终点,记录甲管(空白)、乙管(样品)反应液消耗Na2S2O3标准溶液的体积,同时作平行样品测定。(5)酶活测定方法酶活力单位定义为:1g酶粉或1ml酶液在50℃,pH3.5的条件下,1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。X=(A-B)×C×0.51×194.14×n×10/(5×1×0.5)=(A-B)×C×n×396.05式中:X——样品的酶活力u/g(u/ml);A——空白消耗Na2S2O3标准溶液的体积ml;B——空白消耗Na2S2O3标准溶液的体积ml;C——Na2S2O3标准溶液的浓度mol/l;0.51——1毫摩尔Na2S2O3相当于0.51毫摩尔的游离半乳糖醛酸;194.14——半乳糖醛酸的毫摩尔质量mg;n——酶液稀释倍数;10——反应液总体积ml;5——滴定时取反应混合物的体积ml;1——反应时加入稀释酶液的体积ml;0.5-反应时间h所得结果应表示至整数。2结果与讨论2.1果胶酶稀释个数的确定采用稀释倍数分别为100,200,400,800,1000,1200,1400对液体果胶酶的活性进行了测定,其测定值如表2所示:从理论上讲,酶活力大小与稀释倍数是无关的,即不同的稀释倍数下测得的酶活力为一定值。但是,表1数据并没有显示出这一点,这可能是由于果胶的浓度与酶浓度不配套引起的。由于果胶的浓度相对很小,稀释倍数在1000以内时,酶的浓度始终相对太大,果胶可全部被水解,在这种情况下,稀释倍数越大,其酶活越高。如果这样的话,肯定存在一个稀释倍数点,在这点后,酶活将不会随着稀释倍数的增加而变化,此时酶的浓度已经小于果胶浓度了。从表1数据可看出,稀释倍数在1000后,虽然酶活值有波动,但相对误差已经大大减小了,从变化趋势看有可能找到果胶酶稀释倍数范围。表1数据说明其稀释倍数范围在1000以上。需要强调的是,稀释倍数太大,将会导致较大的滴定误差,所以,稀释倍数应为大于1000,但接近1000。2.2u3000酶活力测定和下相稀释的关系上述分析发现,与果胶酶的活力相比较,果胶的浓度很小时,酶液的稀释倍数越小,测定出来的酶活力要小于稀释倍数很大时的酶活力,而稀释倍数达到一定值后,稀释倍数对酶活力测定值的影响又逐渐减小,如图1所示:当稀释倍数大于临界稀释倍数A值时,不同的稀释倍数下的酶活力相等,在这一稀释范围内,所测得的酶活力才能比较准确地反映出果胶酶的实际酶活力大小。为了进一步证明该推论的正确性,并找到临界稀释倍数A,做了如下实验:用PEG/(NH4)2SO4双水相系统(PEG含量20%)对模拟果胶酶酶液进行了萃取分离,上下相的稀释倍数如表3所示:测得上相数据如表4所示:结果表明:采用上述双水相体系对果胶酶进行萃取,上相中果胶酶酶活的测定采用500稀释倍数比较合适。上相酶活为4500u/ml左右。测得下相酶活数据如表5所示:结果表明:采用上述双水相体系对果胶酶进行萃取,下相中果胶酶酶活的测定采用400或500稀释倍数比较合适。下相酶活为3200u/ml左右。由以上数据结果来看,酶活力与稀释倍数的确定,存在着一定关系,对于该双水相系统,上相稀释倍数要大于500倍,下相稀释倍数要大于400倍,才能得到准确的实验结果。但对于不同的酶液及不同的双水相系统临界稀释倍数A是不相同的。3peg/nh42so4果胶酶稀释计数见表1(1)果胶酶活性测定中,稀释倍数是一个值得注意的问题,要得到可靠的果胶酶活性测定值,需要通过试验找出合适的稀释倍数范围,酶液浓度应控制在消耗0.05mol/LNa2S2O3标准溶液(A-B)之差在0.5-1.0ml范围内,必要时可先做预备试验。而且该稀释倍数范围与果胶浓度