细胞受体的研究进展

细胞受体的研究进展

病毒的细胞受体是指与细胞特定的吸收性和结合，通过细胞渗透和感染主要细胞的膜成分。这对很大程度上决定了病毒的主要演员区域和组织的嗜度。细胞受体可以是单体也可以是多分子复合物,具有特异性、饱和性、高亲和性、靶细胞部位的局限性和独特的生物学活等特点(郭爱珍等,1997)。细胞受体为病毒的识别和吸附提供了条件和基础,病毒与受体结合后引起细胞发生构象变化或胞吞作用从而引起病毒的侵入(Berger等,1999)。所以说病毒与细胞受体结合是病毒感染的首要和必要途径,研究和寻找细胞受体对了解病毒的侵入和作用方式就显得尤为重要。由目前已知细胞受体的化学成分来看,大部分为蛋白质,所以研究细胞受体的方法与研究蛋白质相互作用的方法基本相同。为了能够有效和高效地筛选不同病毒的细胞受体,文章对几种常用的研究细胞受体的方法做了比较和总结。1细胞受体成分病毒的细胞受体是指能被病毒的吸附蛋白(viralattachmentprotein,VAP)所识别并与之发生特异性结合,从而介导病毒感染宿主细胞的一些天然分子(Ursula等,2009)。病毒的细胞受体可以以单体分子的形式存在,也可以以多分子复合物的形式存在。大多数研究结果表明,病毒受体的化学本质是蛋白聚糖、脂或糖脂、糖蛋白,就目前已知的受体成分来看大部分是蛋白质(Rajcani等,2003)。从生物学角度来说,细胞的这些成分并不是专门提供给病毒的,它们是细胞的正常成分,有着正常的生理功能(Tiwariv等,2006)。病毒与宿主细胞的结合是一个特异性的过程,由于病毒受体的特异性决定了病毒的宿主范围和组织嗜性(黄文林等,2006)。一种病毒只能感染一种或一类生物,如新城疫病毒能感染鸡及其他禽类,却不能感染牛和羊。小鹅瘟病毒能感染雏鹅并引起高死亡率,但却不能引起鸡发病。这些都与宿主细胞内特异的受体成分有关。一种细胞受体成分能介导多种病毒感染宿主细胞。以硫酸乙酰肝素作为受体成分的有人类单纯疱疹病毒、登革热病毒、口蹄疫病毒、流感病毒、伪狂犬病毒、人免疫缺陷病病毒等(Depntte等,2005;Dimitrov等,2000;Mettenleiter等,2002;Akula等,2001)。因此,研究细胞的受体成分对阐明病毒的感染过程和致病机理是十分重要和必要的。病毒与细胞受体的结合及相互作用是一个十分复杂的过程。病毒与受体分子结合初期,受体分子通过流动的膜脂质双层发生重排,受体单位(cellreceptorunit)聚集形成受体结合单位。之后,病毒和细胞受体均发生一些变化:病毒出现新的抗原特性,对蛋白酶更敏感;受体细胞膜则发生水化、扭曲等。随后发生融合,病毒融入细胞中。此外,病毒与细胞受体的结合还与pH、温度和离子有关。有些受体不需要借助其他蛋白自身就可以吸附病毒,如唾液酸能直接介导流感病毒的吸附(Stephen等,2001)。而有些病毒不仅需要细胞外受体,同时还需要细胞内受体(Sieczkarski等,2004),如小鹅瘟病毒不仅需要借助细胞外受体进入细胞内,还需要通过细胞内受体才能进入细胞核。2病毒覆盖蛋白结合法研究病毒的细胞受体能帮人们从分子水平上阐明病毒的致病机制,了解病毒与宿主细胞的作用方式及其模式,从而研制有效的疫苗或抗病毒药物,具有重大的理论和实践意义。随着生物技术的不断进步,很多病毒的细胞受体已经找到了,越来越多的细胞受体的研究方法也应运而生。因为目前已知的绝大部分细胞受体的化学本质都是蛋白质,所以研究受体的方法基本上就是研究蛋白质相互作用的方法。下面主要介绍几种常用和实用的研究方法,并对这些方法进行比较,以供大家参考。亲和层析法是病毒受体鉴定中最常用的方法,它是通过细胞膜上的受体蛋白与病毒发生特异性结合来分离鉴定细胞受体的。将病毒或病毒吸附蛋白(viralattachmentprotein,VAP)偶联到亲和层析柱Sepherose4B上然后与完整的细胞裂解液或其中的膜受体成分发生特异性结合,然后利用高浓度的底物溶液进行洗脱,洗脱组分就是病毒的细胞膜受体。黄莎等(2010)对HWTX-1进行了生物素标记,然后利用亲和纯化和化学交联两种方法对HWTX-1在大鼠膈神经—膈肌突触细胞质膜上的受体蛋白进行了分离纯化与鉴定。亲和纯化出几种可能的受体,通过化学交联和Westernblotting检测到了膈肌细胞质膜上HWTX-1受体的存在。该法作为实验室最常用的一种研究蛋白质的方法是因为它的高灵敏性,而它的缺点是载体的价格昂贵,配基的制备也很困难(Cho等,2001)。病毒覆盖蛋白结合法(virusoverlayprotein-bindingassay,VOPBA)是一种较早用来鉴定病毒受体的经典方法。其操作过程如下:首先提取病毒易感细胞的膜蛋白,进行SDS,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,使其与病毒结合,通过化学方法显示能与病毒发生特异性结合的蛋白条带(Salas-Benito等,1997)。使用VOPBA鉴定病毒受体,受体蛋白需要具备以下几个条件:单一多肽就能使受体具有活性,且不需要其他蛋白的辅助;该多肽经去垢剂处理后还能保持其生物学活性。Li等(2009)用VOPBA鉴定唾液酸是3型牛腺病毒的受体。Soma等(2009)也利用该方法找到了日本脑炎病毒的细胞受体—热休克蛋白70(HSP70)。犬瘟热病毒、伪狂犬病病毒的病毒受体都是用这种方法找到的(Rebecca等,1996;Masciopinto等,2004)。利用VOPBA能够准确的知道病毒受体的分子质量大小,从而对未知的受体进行推断,但是不能了解该受体的理化性质等其他信息。所以在受体已知的情况下,只需要对受体进行功能鉴定时,VOPBA不失为一种准确而有效的方法。利用病毒易感细胞的单克隆抗体,该抗体通过与病毒的细胞受体结合阻断病毒与受体的结合,从而阻断病毒的感染。针对这个单抗的膜蛋白就是病毒的细胞受体。其操作方法是先将易感细胞与特异性膜相关蛋白单克隆抗体混合,待其充分作用后进行病毒感染,筛选出未感染的细胞。未感染细胞上的病毒受体与单抗发生结合从而不能与病毒发生反应,所以单抗针对的膜蛋白就是受体。Yang等(2010)利用单克隆抗体的方法在IBDV的敏感细胞—鸡胚成纤维细胞上找到6个相关的细胞受体:1H5、1H11、2B12、3G1、4D10和4B8,其中4B8的阻断效果最好。Dorig等(1994)也用该种方法寻找麻疹病毒受体,该试验用了3000株针对膜蛋白的单克隆抗体进行筛选,最终找到了一株单克隆抗体McAb能阻断麻疹病毒与易感细胞融合。该种方法的特异性比较高,但是工作量大,盲目性也比较大,效率并不是很高,偶然性太大。噬菌体编码5种结构蛋白—PⅢ、PⅣ、PⅤ、PⅦ、PⅧ,这5种结构蛋白构成噬菌体的壳体,其中PⅢ和PⅧ的N末端裸露在噬菌体表面。噬菌体表面展示技术(phagesurfacedisplaytechnique,PSDT)的原理就是把外源基因插入PⅢ和PⅧ基因中,使之与衣壳蛋白融合表达,随着噬菌体的成熟装配,融合蛋白展示于噬菌体的表面并保持较好的空间构象。具体的操作方法如下:首先,扩增噬菌体肽库并将病毒或病毒吸附蛋白生物素化,将两者混合。再用亲和素包被的平板洗脱,重复混合—洗脱过程,获得富集的阳性噬菌体,最后通过PCR扩增、测序,就可知道与病毒结合的短肽的序列,也就是可能的细胞受体的基因序列。Jolly等(2001)通过噬菌体展示技术找到了轮状病毒VP4蛋白在MA104上的细胞受体。噬菌体表面呈现技术也是一种常用的研究病毒受体的方法,因为该方法可以高选择性地筛选复杂的混合物。但是噬菌体本身的基因片段不大,所以就限制了插入DNA片段的大小。由于原核表达系统没有对真核基因内含子的剪接功能,所以噬菌体展示系统只能表达原核生物基因或者是反转录的cDNA。噬菌体表达蛋白的空间构象和构型与天然状态也会有所不同。所以噬菌体表面呈现技术有一定的局限性。免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。其原理如下:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质—蛋白质间的相互作用被保留下来。在溶液状态下或在细胞中,若用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与蛋白质X在体内结合的蛋白Y也能被免疫沉淀下来。此种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合,也可以确定一种特定蛋白的作用蛋白。Baragli等(2007)利用免疫共沉淀研究神经细胞中受体与病毒间的相互作用。Li等(2006)使用该方法研究水痘带状疱疹病毒与细胞受体之间的相互作用。免疫共沉淀可以直接检测细胞提取物,相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态。蛋白质相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。但是它的不足之处是可能检测不到亲和力和瞬间的蛋白质—蛋白质相互作用,敏感性较低,也不能明确是否有第三种蛋白参与结合。酵母双杂交(yeasttwo-hybird,Y2H)的理论依据是大部分真核细胞的转录因子由DNA结合域(bindingdomain,BD)和DNA转录激活域(activationdomain,AD)两部分构成。BD能识别存在于靶基因启动子内特异的核苷酸序列—上游激活序列,并能与之结合。而AD可以激活下游靶基因的转录,从而表达报告基因。BD和AD是同一蛋白的2个不同功能域,它们可以被分开但不能激活转录反应。但是两者在空间上充分接近时,就可以呈现GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,从而转录启动子下游基因。酵母双杂交的一般操作流程:将BD和一个诱饵蛋白的X基因融合构建成一个质粒,将AD与目的蛋白的Y基因构建成另一质粒。将两者转化到带有报告基因的同一酵母菌中,若X、Y之间能相互作用,就能拉近BD和AD的空间距离进而启动报告基因的转录。根据是否转录报告基因来判断两种蛋白之间是否相互作用。Shui等(2011)利用酵母双杂交系统来研究与HIV1囊膜蛋白上的gp41分子的结合蛋白,从而寻找HIV的治疗方法。在国内,李凌云等(2002)利用酵母双杂交系统筛选到了麻疹病毒的一个受体基因。酵母双杂交系统是一种简单、实用的研究方法。由于蛋白质是在酵母体内发生的相互作用,所以该方法的敏感性很高,能检测到少量或微量蛋白间的相互作用。但是该方法的特异性不是很高,很容易出现假阳性的结果。还有两种蛋白质是在细胞核内发生的反应与细胞膜上的反应条件也有差异。GSTpull-down是利用重组技术将诱饵蛋白与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合,融合蛋白通过GST与固化在载体上的谷胱甘肽亲和树脂(GTH)结合。目的蛋白溶液过柱,可以从中捕获与之相互作用的目的蛋白,洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而找到与靶蛋白相互作用的目的蛋白。该方法常常用来验证酵母双杂交的体外试验技术。Saengchan等(2006)建立了Taura病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3的cDNA文库。利用酵母双杂交系统找到细胞受体,再用GSTpull-down进行验证。此种方法简单易行,操作方便。对混合物中的所有蛋白都很敏感,有很高的敏感性。GST有可能会影响诱饵蛋白(靶蛋白)的空间构象,从而影响试验结果。串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是近年发展起来的一种新的纯化蛋白复合物的方法。利用一种经过特殊设计的蛋白标签,经过两步连续的亲和纯化,得到更接近自然状态的特定的蛋白质复合物,能在真实的生理条件下研究蛋白质相互作用的技术。该方法的基本步骤是:在目的蛋白的一端嵌入一个蛋白质标记,然后构建一个表达标记蛋白的细胞或组织,准备细胞抽提物,最后进行蛋白的纯化。Xiang等(2006)利用TAP寻找丙型肝炎病毒E1、E2糖蛋白的相互作用成分CD81。串联亲和层析常用来检测蛋白质复合体中的新组分,由于经过两步亲和纯化,所以纯化产物的特异性相对较高,周期短,假阳性结果也很少。此外该方法还可以用来大规模地研究细胞内蛋白质分子之间的相互作用网络。它的不足之处有:TAP标签的引入会影响蛋白质的表达;靶蛋白在TEV蛋白酶处理的过程中可能被破坏;纯化过程中EGTA或其他溶剂的使用会干扰复合物的完整性和活性过程(吴丽民等,2009)。除了上述介绍的8种方法之外还有质谱分析,表面等离子体共振、cDNA文库、流式细胞术、抗独特型抗体等方法可用于研究病毒的细胞受体。3常用的研究方法大部分病毒受体是存在细胞膜上的复杂的化合物,含量很少,用一种方法来研究病毒的细胞受体是不太现实的。一般利用两种或两种以上的方法