水稻籽实中砷的结合形态及其稳定性研究

水稻籽实中砷的结合形态及其稳定性研究

1人体害作用元素由于矿工活动和植物环境中添加量的逐年增加，食物和其他农产品中的as污染日益严重。因此，人类经常将as作为食物摄入中毒的例子。根据研究，as是一个对动植物具有强烈毒性的因素，可能会导致各种人类疾病和致癌性疾病。as的毒性与存在形式密切相关。海产石油通常拥有大量as，国外对as的分布和组合进行了研究。谷物是人们的主要食物。它在国内外对重金属cd、pb和其他元素的结合形态进行了研究，但粮食和其他作物籽中as的存在形式和毒性没有系统的研究。作者在水稻果实中研究了as的分布、加工过程中的去除及其存在形态。结果表明，谷物中的as主要与蛋白质结合。在此基础上，我们进一步研究了水稻果实中蛋白质-as的结合形态特征及其稳定性，为评估动物和人类的毒性提供了科学依据。2材料和方法2.1试验样本试验所选用的水稻籽实采自湖北省大冶铜矿地区附近的污染农田,糙米中As的浓度为0.685μg·g-1.2.2洗脱活性和核心质量标准的测定将水稻籽实粉碎后,按国家标准方法(GB2906-82)脱去脂肪,风干后称取适量,用0.05MTris-HCl(pH7.5)进行提取,样品与提取液之比为1∶10.将提取液样品置于冰箱内10h后,在20000g的高速冷冻离心机中离心1h,取上清液于冰冻干燥箱内浓缩5倍.取浓缩样品1ml用0.05MTris-HCl溶解,经SephadexG75柱进行层析分离(2.0×100mm).用0.02MTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱.用自动部分收集器(BS2-100)以4ml·20min-1的流速,每管4ml收集洗脱液.紫外分光光度计(BECKMANDU-8B)测定洗脱液的紫外吸收峰(225nm处),并同步测定洗脱液中的As浓度.采用标准蛋白质曲线法测定洗脱液样品的分子量.标准蛋白质为:牛血清清蛋白(分子量66000)、鸡卵清蛋白(分子量45000)、胰蛋白酶(分子量24000)、细胞色素C(分子量12400),胰岛素(分子量5734),均为层析纯.标准蛋白质混合液与样品相同的处理方法经SephadexG75柱层析,绘制蛋白质标准曲线.2.3氨基酸测定按GB7649-87方法,用Biochrom20专业氨基酸分析仪(瑞典)对洗脱液样品中的17种氨基酸含量进行分析.2.4制备大米蛋白和凝胶层析分离准确称取一定量的被研磨的稻米置于烧杯中,加适量的去离子水,在电炉上加热,煮熟成米饭.然后,按2.2的方法提取蛋白质和凝胶层析分离.2.5胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化实验2.5.1输注3.3.3m0胃蛋白酶溶液(16mg·L-1):称取胃蛋白酶160mg(Pepsin1∶10000,539units·mg-1,华美生物工程公司),溶于10ml0.02MTris-HCl溶液.胰蛋白酶溶液(30mg·L-1):称取胰蛋白酶300mg(Trypsin1∶250,BE2185,华美生物工程公司),溶于10ml0.02MTris-HCl溶液.2.5.2t保酶凝胶层析人工酶凝胶层析5ml冷冻干燥的水稻蛋白质提取液,分别溶于1ml胃蛋白酶溶液和1ml胰蛋白酶溶液,对照组分别加1ml无酶的0.02MTris-HCl溶液,37℃恒温培养5h,然后按2.2的方法凝胶层析过柱分离.2.6分析方法的确定对前述各组样品进行消化,方法按文献进行,然后利用氢化物-原子吸收方法测定样品中的As(仪器型号:GBC906,HG3000,澳大利亚).为了保证分析方法的准确性,采用了国家标准物质茶叶样品(GBW07605)进行质量控制.3结果与讨论3.1洗脱液中as的浓度分布脱脂水稻籽实样品经Tris-HCl提取后,利用SephadexG75柱进行层析分离,分析洗脱液中蛋白质紫外吸收峰(OD值)和对应的As浓度分布,结果见图1.由图1可以看出,洗脱液出现3个明显的紫外吸收峰,分别出现在洗脱液第15管(1峰)、31管(2峰)和44管(3峰)处.比较3个紫外吸收峰的OD值大小,第一峰高而窄,第二峰最小,第三峰高而宽,表明水稻籽实中的蛋白质主要集中在第一和第三峰处,经与相同条件下的标准蛋白质曲线对照,3个峰的表观分子量分别为54.5、16.04和5.5KD.从洗脱液中As的浓度分布看,出现了两个明显的As峰,其出现位置恰与第一和第三个紫外吸收峰相重合,第二紫外吸收处也有少量As分布.由此推断,水稻籽实中存在的As主要与表观分子量为54.5KD和5.5KD的蛋白质(或多肽)结合,形成蛋白质-As结合体.3.2蛋白质的氨基酸组成为进一步了解蛋白质-As结合体的氨基酸组成,对经凝胶层析分离得到的3个蛋白质(多肽)的17种氨基酸组成进行了分析,结果见表1.由表1可见,第Ⅰ和第Ⅲ蛋白质组分的氨基酸组成有明显相似的趋势,均以Glu、Val、Ile、Leu、Arg、Cys的含量较高.这6种氨基酸之和可占氨基酸总量的63.4%(图1中1、3组分),两个组分中均未检到Pro,Ser和Thr的含量均较低.第II蛋白质组分的氨基酸组成与第Ⅰ和第Ⅲ的主要区别在于Glu的含量明显较低.以上结果表明,水稻籽实中不同分子量或不同类型蛋白质的氨基酸组成有一定差异,其与元素As的结合能力也不同.但是,对含Se蛋白质的类型、结构及其稳定性等仍需进一步研究.3.3-也是coa的结合体的稳定性3.3.1紫外吸收法检测双峰红松林洗脱液中as的浓度变化稻米经过蒸煮变成米饭,加热的作用会使稻米里的蛋白质发生热变性.图2为蒸煮后的水稻籽实Tris-HCl提取液的凝胶层析结果.与对照比较(图1),蒸煮后的洗脱液中原有的3个蛋白质紫外峰的OD值都明显变小,特别是第一峰下降明显,在第三峰后原来没有紫外吸收的地方也出现了紫外吸收.同时,洗脱液中As的浓度峰也有明显的变化,原来对照组中出现的两个明显的As浓度峰在蒸煮加热后不明显,在1~3峰之间的洗脱液中As的浓度都较低,而在第三峰之后新出现紫外吸收的洗脱液中也出现了As的浓度分布.上述结果表明,蒸煮加热能够使水稻蛋白质-As结合体发生变化,原因可能是蒸煮加热使蛋白质发生热变性,蛋白质凝结,变成不可溶,因此,不能透过凝胶柱,使峰1和峰2几乎消失;也有可能破坏了蛋白质的二级结构,使原有的一些大分子的蛋白质-As结合体发生改变,或者分解变成蛋白质小分子或多肽.因此,与蛋白质结合的As也被释放出来,或者变成小分子的结合体形式.3.3.2洗脱液中as的浓度分布图3为水稻籽实蛋白质经胃蛋白酶消化后的凝胶层析结果.在胃蛋白酶的作用下,洗脱液的蛋白质紫外吸收峰发生了改变,第一个紫外吸收峰的OD值明显低于未加酶的对照组,第二峰比对照组稍微降低,而第三峰的OD值变化不明显.洗脱液中As的浓度分布比未加酶的对照组洗脱液浓度分布有所变化,第一、第三紫外峰处的As浓度降低,而在第三峰之后的洗脱液中没有紫外吸收,但可见As的浓度分布.由此可以推断,新出现的As浓度分布是由第一峰蛋白质-As结合体分解所形成的,可能是一些小分子的肽类结合或游离的As离子.上述结果也说明,胃蛋白酶主要对分子量为54.5KD的蛋白质-As结合体(第一峰)发生作用,从第三峰处As的浓度下降,说明胃蛋白酶对分子量为5.5KD的蛋白质-As结合体也有一定的影响.3.3.3胰蛋白酶对第一峰处的蛋白质分子中as的浓度分布及最佳剂量的确定水稻籽实蛋白质经胰蛋白酶消化后的凝胶层析结果见图4.在胰蛋白酶作用下,洗脱液的第一紫外吸收峰完全消失,第二峰变化不明显,第三峰的形状与对照组基本一致.由此可见,胰蛋白酶能够彻底分解第一峰处的蛋白质分子,即54.5KD的蛋白质分子,洗脱液中As的浓度分布也主要出现在第三峰及之后的洗脱液中.与上述胃蛋白酶消化结果比较,胰蛋白酶对分子量为54.5KD的蛋白质-As结合体分解得更彻底,而对5.5KD的蛋白质-As结合体的影响相对小些,说明不同分子量蛋白质之间所形成的结合形态及其稳定性存在一定的差异.3.4不同形态及铜胁迫对稻米中as、as、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、dmaa和dmaa的变化已有研究表明,食品中As能以多种形态存在,常见化合物有亚硒酸盐(As3+)、硒酸盐(As5+)、一甲基硒酸(MAA)、二甲基硒酸(DMAA)、三甲基硒酸(TMA)、硒甜菜碱(AB)和硒胆碱(AC)等,各种不同形态的硒化合物具有不同的毒性,其毒性顺序为As(Ⅲ)>As(V)>MAA>DMAA>AB,AC.日本山内等也证实稻米中含有As3+、As5+、MAA和DMAA等形态,其中以As5+为主,其次是DMAA、As3+和MAA.动物实验表明,不同的As化合物