peg磷酸盐双水相系统相分离过程及相分配特性研究

peg磷酸盐双水相系统相分离过程及相分配特性研究

双水相萃取系统是由两种不同化学结构的亲水性高聚物或亲水性高聚物和盐场以适当的浓度形成的两水相系统。生物颗粒或生物大物质的两个可能部门之间的差异引起的分离分离技术称为双水相萃取技术。由于其稳定的分离条件、操作稳定、调整因素，以及传统的溶剂萃取的成功经验，它被认为是一个应用广泛的生物下游项目。1955年，瑞典尤普勒大学的p.b首先利用了双水相技术，将颗粒颗粒分离到细胞中。到目前为止，它不仅通过双水相萃取技术分离和提取了许多生物对象，而且在动力学研究、双水亲水和分离、多阶段逆流分析、反应分离、生物分离技术的相互应用等方面取得了巨大成功。本文拟制作PEG/磷酸盐双水相系统相图,并对不同组成的双水相系统相分离过程和牛血清蛋白(BSA)在该双水相系统中的分配特性进行初步研究.2结果与讨论2.1节线形成的比较在25℃下,制作PEG6,000/磷酸盐和PEG10,000/磷酸盐双水相系统相图,如图1所示.相图中在双节曲线(binodalcurve)下方的点表示的组成只能得到单相系统,而在其上方的点表示的组成则可以得到两相系统。在双节曲线的临界点(criticalpoint,相图中的点C)上,两相的组成变为相同,两相变为一相.节线(tielines)TMB联结相互平衡的两相,系统M相分离后可以得到相T和下相B,并且上、下两相的质量比遵循杠杆规则.从图1可以看出,PEG/磷酸盐双水相系统的上相中富含PEG,下相中富含磷酸盐.随着整个相系统浓度的增大,节线变得越长,即上、下相的组成差别越大,上相中所含有的PEG越多而磷酸盐越少,下相中则含有更多的磷酸盐而更少的PEG,因此,上、下相的物理化学性质(如密度、粘度)的差别也越来越大.而且,PEG6,000/磷酸盐系统的分相临界点组成浓度比PEG10,000/磷酸盐系统的分相临界点组成浓度高,这是因为分子量大的PEG在水中的溶解度大.2.2双水相系统相分离动力学过程在25℃下,所选的5种不同组成的双水相系统的上、下两相相比小于1.0,因此,本研究将下相视为连续相,上相视为分散相.图2所示为不同组成的双水相系统在相分离过程中,分散相(上相)V′t体积占上相总体积Vt百分比随相分离时间t变化的曲线.尽管组成不同的系统之相分离时间不同,但从图上可以看出,每个组成的相分离过程经历了初始加速阶段、中间恒速阶段和最终减速阶段.有些组成的双水相系统各阶段分布十分明显如组成为2,3和4的系统,而组成为1和5的双水相系统的3个阶段分布不明显.一般认为,上下两相间的密度差是双水相系统相分离的推动力,但是,对整个相分离过程来说,这个复杂的运动过程涉及到分散相液滴的碰撞、粘合以及与连续相的相互作用等,因此,有关双水相系统相分离动力学过程有待进一步研究探讨.2.3bsa在peg-iii相系统中的分配性能2.3.1peg6分配系数对bsa的影响在25℃下,保持PO3−443-浓度6%不变,移取BSA原液1mL,改变PEG6,000浓度,结果见图3.从图3可见,在所选的PEG6,000浓度范围内,BSA的分配系数先降低后升高,但数值变化不大,仅在0.14～0.20间波动.由于PEG粘度较大,随着PEG浓度增加,使溶液粘度增加,相分离时间变长.在25℃下,保持PEG6,000浓度10%不变,移取BSA原液1mL,改变PO3−443-浓度,结果见图4.从图4可见,分配系数随PO3−443-浓度的增加而增加,PO3−443-浓度从6%增至11%,分配系数从0.152增至0.815.可能的解释是,随着PO3−443-浓度的增加,PO3−443-对BSA的盐析作用加强,使BSA分配于上相的量增加.在实验过程中还发现,双水相系统相比随PEG浓度增加而增加,随PO3−443-浓度增加而减少.从图3,图4的结果来看,虽然分配系数随PEG、PO3−443-浓度而变化,但其值均小于1,且在适宜的成相浓度下,BSA在下相分配率很高,因此,BSA适合分配于富盐的下相,而不宜分配于富PEG的上相,这是因为除了BSA与PEG大分子结构的空间排斥作用外,BSA与PO3−443-间的电荷相互吸引,因而产生较高的盐溶作用.在所选的PEG6,000/磷酸盐成相浓度范围内,综合考虑BSA在上下相间的分配系数、BSA下相分配率,系统相比及系统粘度等因素,采用组成为PEG6,00010%(w/w)PO3-460%(w/w)的双水相系统萃取BSA为宜.2.3.2加固nacl对bsa的分配特性影响NaCl是最常用的研究盐效应影响双水相系统中分配特性的一种试剂.在25℃下,采用PEG6,00010%(w/w)PO3-46%(w/w)系统,加入BSA原液1mL,以加入固体NaCl的方式改变系统中的盐浓度,结果如表1.从表1可以看出,外加不同浓度的NaCl对相比分配系数及下相分配率的影响不大.磷酸盐与NaCl的组合对BSA几乎不产生盐析作用,因此,外加NaCl对BSA在PEG/磷酸盐双水相系统的分配特性影响不显著.2.3.3双水相生物酶bsa在双水相系统中ct的相差在25℃下,采用PEG6,00010%(w/w)PO3−443-6%(w/w)系统,改变BSA的起始浓度,结果发现,起始浓度的变化对相比影响较小,在0.72～0.78范围内变动,而对分配系数的影响则较大,BSA起始浓度为107.18μg/mL的分配系数(K=0.339)与起始浓度为769.33μg/mL的分配系数(K=0.042)相差近一个数量级.相关研究指出,BSA在上相浓度Ct可以采用“饱和型”曲线表示:Ct=CM⋅C0Cs+C0(4)Ct=CΜ⋅C0Cs+C0(4)式中,C0是BSA在双水相系统中的总浓度;CM是BSA在上相的最高浓度(受限于溶解度):Cs类似于热力学平衡常数.本实验结果经数据处理后,得到PEG6,00010%(w/w)PO3-46%(w/w)系统平衡时上相BSA浓度随起始浓度变化的关系式为:Ct=56.83⋅C020.76+C0(5)Ct=56.83⋅C020.76+C0(5)下相BSA浓度采用线性方程表示可得到较好的拟合效果(相关系数r2=0.9984),关系式为:Cb=1.68C0(6)将式(5)、式(6)代入式(2),可得到BSA在PEG6,00010%(w/w)PO3−443-6%(w/w)双水相系统的分配系数K为:K=CtCb=33.8320.76+C0(7)Κ=CtCb=33.8320.76+C0(7)将式(5),(6),(7)所表示的拟合曲线与实测值进行比较,结果如图5,图6所示,可见式(5),(6),(7)均能较好地与实验结果相吻合.3peg6,0.7相分离动力学(1)采用喹钼柠酮重量法测定双水相系统下相溶液的PO3−443-浓度,采用冷冻干燥法测定其PEG浓度,通过计算得出上相溶液的PO3−443-和PEG浓度,成功地制作了PEG6,000/磷酸盐和PEG10,000/磷酸盐两个双水相系统的相图,并对相图特征作了概括.(2)研究了5种不同组成的PEG6,000/磷酸盐双水相系统的相分离过程,得到了分散相体积百分率随时间的变化曲线,发现,相分离过程大致经历了初始加速阶段、中间恒速阶段和最终减速阶段,有关相分离动力学的深入研究有待进一步进行.(3)在PEG6,000/磷酸盐双水相系统中,BSA更宜分配于下相,成相组成为PEG6,00010%(w/w)PO3−443-6%(w/w)的系统最有利于B