植物生理学实验：实验二 叶绿素a、b含量测定

植物生理学实验

实验二叶绿素a、b含量测定实验原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。实验原理各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。实验原理叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此得出以下公式:

色素浓度计算公式（浓度单位：mg·L-1）

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/245实验目的；实验材料、仪器设备与试剂目的：掌握在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算；巩固分光光度计的使用。材料：白兰叶片仪器设备：

分光光度计，天平，研钵，容量瓶，漏斗，滤纸，滴管试剂：

95％乙醇，石英砂，碳酸钙粉实验步骤1、取新鲜白兰叶片，擦净表面，去掉中脉，剪碎混匀。2、称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研磨成均浆，再加95％乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3、取滤纸1张，置漏斗中，用95％乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中，用少量95％乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。实验步骤4、用滴管吸取95％乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95％乙醇定容至25ml，摇匀。5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度（调节波长旋钮，选择所需测的波长。盖上样品室盖，使光路通过参比溶液比色皿。将选择开关调至“A”，调节吸光度旋钮，使数字显示为“000.0”。再将被测溶液置于光路后，数字显示值即为溶液的吸光度）。实验步骤吸光度色素浓度（mg·L-1）组织中各色素含量（mg·g-1）样品质量提取液总量A665A649A470CaCbCTCx·CCa'Cb'CT'Cx·C'Ca/Cb6、将上述数值填入书上表2-12-1中（不要求重复组）。实验结果计算与分析1.将测定得到的吸光值代入下面的式子，计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度(mg.L-1)以及叶绿素总浓度，叶绿素a/b的浓度比值。

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C

=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/2452.最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

色素的浓度(mg.L-1)×提取液体积(mL)（×稀释倍数）样品鲜重(g)×1000注意事项1、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行；研磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。2、过滤时必须将滤纸及叶片残渣洗至无绿色为止。比色时提取液不能混浊。3、比色杯光学面保持清洁；换样品时倒净即可，不需润洗。4、样品浓度控制在吸光度值0.2-0.8范围之间进行测定，如超出此范围可适当稀释（或浓缩）。5