21固相析出分离技术

2.1出分别技术。依据析出物的形态不同分为结晶法〔结晶析出〕和沉淀法〔无定形固体析出〕第一节沉淀分别技术〔如蛋白质分子外表疏水基团和亲水基团比例的差异〕来转变溶液的某些性质〔如pH子等，使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而到达从抽提液中分别有效成份的目的。一、盐析沉淀法盐析的原理定义：一般在低盐浓度的状况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的上升而增加，这种现象称为盐最终引起蛋白质分子间相互聚拢并从溶液中析出。盐能够转变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有亲热关系。两者的关系可用下式表示：lg〔S/So〕=-KsISI(g/L)；So0度；KsI在温度肯定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可改写为：lgS=lgSo–KsI=β–KsIβ=lgSo为一常数β值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pHKs，Ks好。pHβKs蛋白质的溶解度打算于离子强度Ｉ,Ｉ可用下式计算：Ｉ=1/2∑mZ2iim:溶液中离子的摩尔浓度Zi i盐的选择：蛋白质的盐析通常承受中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用子的力量也大，成为有效的盐析工具。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小 (25℃时溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分别效果比其他盐好。Ks3通常硫酸铵的添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，例如大局部蛋白质可在80%硫酸铵饱和度下沉淀。由于硫酸铵参加的体积很大，会转变最终的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。用硫酸铵进展盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：〔1〕参加饱和溶液法要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高V=V(S-S/〔1-S〕V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V；S0 2 1 2 0 2S150－60℃，0℃1－2100％饱和度。2)参加固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积t=G(S-S/〔1-AS〕S2，S1:分别代表所需到达的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t1LS12 1 2t〔留意：0℃，25℃25℃〕影响蛋白质盐析的因素：蛋白质浓度〔共沉现象25－30g/L。离子强度和离子类型的影响a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可承受分步盐c.离子强度一样时，高价离子，半径小的离子盐析力强大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。〔4〕a.在低离子强度或纯水中，温度上升，溶解度增加；b.在高盐溶液中，温度上升，溶解度降低。25℃0℃时溶解度低，更简洁盐析。实际使用：制备初期：pH，温度肯定，转变盐浓度〔离子强度〔KspH度〔β分段盐析〕lgS=lgSo–KsI=β–KsI盐析时的留意事项1〕添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min〔2〕同一溶液中欲分别几种蛋白质时，可承受分段盐析的方法。盐析〔3〕选择好温度，一般在室温下进展〔4〕25－30g/L；低浓度盐析，可用离心分别；高浓度盐析70－80％，用过滤〔由于粘度大，离心操作慢；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。二、有机溶剂沉淀法〔一〕〔1〕〔2〕度降低。使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出的沉淀简洁过滤或离心分别，区分力比盐析法好，溶剂也简洁除去。应马上用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避开变性。本钱较高，有肯定的危急性。中性盐可削减在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操pH〔1〕〕〔3〕样品稳定构造范围内，选择溶解度最低处的pH〔4〕留意离子强度，离子种类的影响。〔二〕有机溶剂的选择和浓度的计算来进展有机溶剂沉淀。〔三〕有机溶剂沉淀的影响因素1温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反响，因此必需预冷，操作要在冰盐浴中进展，参加有机溶剂时必需缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。2.样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进展沉淀。高浓度样品，可以节约pHpH离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。5.其他金属离子一些金属离子如Ca2,Zn2+度而不影响其活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。留意：沉淀所得的固体样品，假设不是马上溶解进展下一步的分别，则应尽可能抽干沉淀，削减其中有机溶剂的含量，如假设必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。三、其他沉淀法等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进展分别纯化的方法称为等电点沉淀法。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消退了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有肯定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法常常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主pH止局部过酸或过碱。〔二〕非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇PEG，葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。机率。1〕〔2〕〔3〕用：沉淀分别细菌，病毒蛋白。〔三〕成盐沉淀法离子

、

、Pb2＋〔2〕〔3〕无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋选择性变性沉淀法：选择肯定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。⑴热变性利用生物大分子对热的稳定性不同，加热上升温度使非目的生物大分子变性沉淀而保存目的物常在冰浴或冷室中进展。的分别纯化步骤。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。其次节 结晶法结晶是制备纯物质的有效方法。在生物技术中，结晶主要应用于抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的生产中，以作为精制的一种手段。固体有结晶和无定形两种状态，两者的区分在于它们的构成单位的排列方式不同，前者有规章，后者无规章。由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶过程有很好的选择性，析出的晶体纯度较高。结晶1化肥如硝酸铵、氯化钾、尿素、磷酸胺等世界的年生产量亦已超过了100产中,虽然结晶态产品产量相对较低,但具有特别重要的地位以及高额的产值。在冶金工业、材料工业中,结晶亦是关键的单元操作。值得留意的动向是在高技术领域中,结晶操作的重要性与日俱增,例如生物化肥、味精、洗衣粉、速溶咖啡、青霉素、红霉素等产品的生产一般都包含有结晶过程。经过结晶后的产品,均有肯定的外形,便于枯燥、包装、运输、贮存等,从而可以更好地适应商品市场的需要。相对于其他化工分别操作,结晶过程有以下特点：运输、储存或使用上都较便利。(2)、对于很多难分别的混合物系,例如同分异构体混合物,共沸物,热敏性物系等,使用其他分别方法难以奏效,而适用于结晶分别。(3)、结晶与精馏、吸取等分别方法相比,能耗低得多,因结晶热一般仅为蒸发潜热的1/3~1/10。又由于可(4)、结晶是一个很简单的分别操作,它是多相、多组分的传热-传质过程,也涉及到外表反响过程,尚有晶体粒度及粒度分布问题,结晶过程和设备种类繁多。近20年来,结晶技术理论分析和工业技术与设备的开发取得刻的生疏。结晶技术。结晶过程的实质外表化学反响过程。一、结晶的过程结晶包括三个过程：1.形成过饱和溶液；2.晶核形成；3.晶体生长。称为结晶热。相反的状况，即溶解时放热，结晶时吸热，比较少见。因此结晶又是一个同时有质量和热量传递的过程。溶液结晶按过饱和形成的方式不同可将溶液结晶分为两大类。①、不移除溶剂的结晶法不移除溶剂的结晶法亦称为冷却结晶法,根本上不除去溶剂,而是使溶液冷却而成为过饱和溶液而结晶。适用于溶解度随温度下降而显著减小的物系,如硝酸钾、硝酸钠、硫酸镁等溶液。具有中等溶解度的物系如氯化钾、硫酸镁等溶液。此外,也可依据操作是否连续,将结晶操作分为间歇式和连续式,或按有无搅拌装置分为搅拌式和无搅拌式等。过饱和溶液的形成盐析结晶。过饱和溶液的形成等溶剂结晶〕适用于溶解度随温度上升而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中；自然冷却、间壁冷却〔冷却剂与溶液隔开、直接接触冷却〔在溶液中通入冷却剂〕局部溶剂蒸发法〔等温结晶法〕适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度上升溶解度降低的体系；加压、减压或常压蒸馏真空蒸发冷却法使溶剂在真空下快速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和局部溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。设备简洁、操作稳定化学反响结晶参加反响剂产生物质，当该物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出；其方法的实质是利用化盐析结晶参加一种物质于溶液中，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶的方法。常用的沉淀剂：固体氯化钠、甲醇、乙醇、丙酮a.承受第四种方法结晶多粘菌丝EE近中性，加等量丙酮，其硫酸盐就结晶析出。b.并用第一、第四种方法结晶C.并用其次、第一种方法结晶1052h，即可得结晶。d.并用第一、第三种方法结晶pH4.810℃，2h2核的形成初级成核二次成核31〕初级均相成核：指溶液在较高过饱和度下自发生成晶核的过程。2〕初级非均相成核：指溶液在外来物晶体与搅拌器或器壁碰撞时所产生的微小晶体的诱导下发生的〔生产较多承受晶过程的完毕，还要靠集中而连续成长为晶体。溶质质点〔分子、原子、离子〕在晶核上连续一层层排列上去而形成晶粒，并且使晶粒不断增大，此即晶体的成长。在过饱和溶液中，当能量在某一瞬间、某一区域临时到达较高值时简洁形成晶核；成核的速度随温度上升而上升，但到达最大值后，温度再上升，速度下降；结晶水越多，越不简洁成核。对于有机物质，构造越简单，分子量越大，成核速度越慢；机械振动、搅拌能促使成核，电磁场、超声波、紫外光等都能促进成核；参加晶体能诱导结晶。晶体的生长晶体生长的集中学说溶质通过集中作用穿过靠近晶体外表的一个滞流层，从溶液中转移到晶体的外表；到达晶体外表的溶质长入晶面，使晶体增大，同时放出结晶热；结晶热传递回到溶液中；晶体。当晶核生成速度大大超过晶体生长速度时，则得到细小而又不规章的晶体。结晶操作中的问题。1．过饱和度增大溶液过饱和度可提高成核速率和生长速率，有利于提高结晶生产力量。过饱和度过大会消灭问题：1〕成核速率过快，产生大量微小晶体，结晶难以长大；2〕结晶生长长速率的同时，不影响结晶的质量。在不易产生晶垢的过饱和度下进展。，假设降温速度过快，溶液很快到达较高的过饱和度，生成大量微小晶体，影响结晶产品的质量。温度最好掌握在饱和温度与过饱和温度之间。不设外部循环加热装置，蒸发室内温度较低，可防止过饱和度的猛烈变化。产品质量。为获得较好的混合状态，同时避开结晶的裂开，可承受气提式混合方式，或利用直径或叶片较大的搅拌桨，降低桨的转速。pHpHpH晶种晶核的形成有两种状况,即初级成核和二次成核。初级成核的速率要比二级成核速率大得多,而且对过饱和度的变化格外敏感,故其成核速率很难掌握。因此,除了超细粒子制造外,一般结晶过程都要尽量避开发生初级成核,而应在有人为参加晶种的状况下进展。晶种的作用主要是掌握品核的数量,以得到粒度把握好时机,假设溶液温度较高,参加的晶种有可能局部或全部被溶化而不能起到诱导成核的作用;假设温以使其均匀地分布在溶液之中,得到高质量的结晶产品。产速度(产量)。但晶浆浓度过高时，悬浮液的流淌性差，混合操作困难。晶浆浓度应在操作条件允许的范围内取最大值。在间歇操作中，晶种的添加量应依据最终结晶产品的大小，满足晶浆浓度最大的高效生产要求。共存杂质的影响明显影响。但假设在结晶操作中杂质含量不断上升(如承受蒸发式结晶操作时)，杂质的积存会严峻影响目标产物结晶的纯度。结晶操作中需要掌握杂质的含量，往往在结晶系统中增设除杂设备。离子交换柱或废液排放。重结晶经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有肯定量的杂质。此时工业上常常需要承受重结晶的方式进展晶，以获得高纯度的晶体的操作。重结晶