花粉生活力测定方法研究进展

花粉生活力测定办法研究进展摘要:总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了多个办法的优缺点。核心词:花粉花粉活力测定办法花粉是高等植物的雄性配子体,在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象,也是孢粉分析、蜂群哺育、药品制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉含有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中,研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作普通会碰到花期不一致带来的困难,为解决这一难题,保存花粉的活力成为重要手段,而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定办法不同。因此,掌握花粉活力的检测办法对提高育种效率有较高的作用和意义。综合前人的研究成果,花粉生活力的检测办法能够分为四大类:①染色法;②萌发测定法;③田间授粉检测法;④形态测定法、无机酸检测法。1染色法1.1TTC染色法TTC即2,3,5-氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料,水溶液无色。基本原理是[1]:当TTC渗入细胞后,碰到活细胞里的脱氢酶接受氢离子,由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物,由此来判断花粉的生活力。具体操作环节:①配制PH为7.17的磷酸缓冲液。称取0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于100ml的蒸馏水中,调节pH为7.17。②TTC溶液配制。根据不同植物称取0.02~1.0g的TTC溶于100ml的磷酸缓冲液中,于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上,加上一滴TTC溶液,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,然后放置于35℃的恒温箱中染色15~20min。④镜检。于10×10倍镜下观察,凡含有活力的花粉被染成红色,部分丧失活力的呈现粉红色,无色的是的或不育的花粉粒。凌春英,肖恩等的研究[2]得出常温、黑暗条件下用TTC染色12h可达成较好的观察效果,并认为TTC法是大花蕙兰和墨兰花粉活力测定便捷、有效的办法。程伟[3]在研究西南桦花粉时通过与离体培养法比较认为TTC法是快速检测西南桦花粉生活力的最适宜办法,并得出TTC的适宜pH值为7.0。胡君艳,李云,孙宇涵[4]认为TTC法测得银杏花粉的活力相对于I-KI法、过氧化物酶法,最靠近离体萌发法测得的花粉活力,一种较为精确的测定银杏花粉生活力的染色法,且染色5min的效果最佳。魏佳[5]在研究百子莲属五个品种的花粉活力时得出TTC法不适合百莲子属花粉活力的检测。另外该法还应用于葫芦科[6]、当归[7]、番木瓜[8]、连翘[9]、人心果[10]、一串红[11]、月季[12]等花粉活力的检测。但是该法染色后的花粉颜色差别小,有活力的花粉边沿被染成红色,中间呈现黄褐色,而无活力的花粉整个呈现黄褐色,在显微镜下不易分辨[13;14]。1.2醋酸洋红染色法醋酸洋红染色法的染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色,有活力的花粉被染成红色,部分失去活力的呈现粉红色,而无活力或不育的花粉无色[15;16]。邢虎成、揭雨成、周清明用醋酸洋红对15种苎麻花粉生活力测定时,发现只有一份的花粉活力为58%,其他的活力都在85%以上,而用离体培养得出萌发率最高的为50%,通过对比认为醋酸洋红发不适合苎麻花粉生活力的快速检测[17]。许利彩、李海真、沈火林认为醋酸洋红法不适合西葫芦花粉活力的测定[16];郭庆、王德斌等用醋酸洋红法测定海棠藤花粉活力,所得效果不抱负,可能是与海棠藤特殊的花粉块构造有关[15],该法在鸢尾属花粉上效果不明显,成果不稳定[18]。然而该法在澳洲坚果[19]、胡萝卜[20]、马铃薯[21]等花粉生活力快速检测上得到广泛的应用。2I-KI染色法I2-KI染色法的基本原理是:根据淀粉遇碘变蓝的特性,根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量,从而拟定花粉粒活性的高低。但在无活力的花粉中也会存在淀粉,这就使得该法测出来的值偏高,对淀粉含量低的花粉不合用,如菊属植物[22]。秦贺兰、贾宗锴等研究[23]温室内栽培的万寿菊花粉时,发现I2-KI染色法与TTC染色法所得成果相似,综合两种办法所用试剂的特点,认为I2-KI染色法更适合万寿菊花粉活力的速测。通过研究得出,该法在防风[14]、穿龙薯蓣[13]、玉米[24]、西南桦[3]等植物花粉上的速测效果比不上其它的染色方式。另外该速测办法也在刚竹属[25]、水稻[26]、苜蓿[27]、辣椒[28]等的花粉速测上得到应用。2.1过氧化物酶染色法过氧化物酶染色法又称联苯胺染色法,是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的活力。由于有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶,所用试剂与过氧化物酶发生氧化反应而染色,有活力的花粉被染成红色,无活力的花粉则呈现黄色或无色透明。胡君艳、李云、孙宇涵等在研究[4]银杏花粉活力时,发现染色界限不明显,且染色液中的双氧水使溶液产生许多小气泡,不利于观察计数,测得成果偏低,不适合银杏花粉生活力的检测。王苗苗、唐灿明[29]在研究高温逆境对棉花花粉的影响时,得出的结论是,过氧化物酶法适合在非逆境下花粉活力的检测,而不适合检测高温逆境下的花粉活力,由于高温下花粉内的过氧化物酶活性减少。而在其它的研究中,则得出的结论是过氧化物酶法适合蒙古扁桃花粉[30]、台湾恺木花粉[31]、野生樱桃李花粉[32]的检测,该染色法优于其它的染色法,与萌发法的成果最靠近。2.2MTT染色法MTT染色法是根据花粉粒中脱氢酶的活性判断花粉生活力,合用试剂是四唑盐类染料,染料的配制办法为:1%2,5-联苯四唑溴化物(MTT或噻唑兰溶于5%蔗糖[33]。镜检时,花粉呈现蓝色表明花粉有活力。张妍[13]等比较多个办法测定穿龙薯蓣花粉的活力,得出MTT法是适宜于穿龙薯蓣花粉活力的检测。蒲高忠[34]等用该法测定桂林唇柱苣苔和百寿唇柱苣苔的花粉活力,得到明显的效果,刘拂晓[35]等应用该法检测新疆野杏花粉活力,也得到同样的成果。而姜雪婷[36]等应用多个办法测定梨的43个品种,通过比较认为MTT法不适合梨花粉活力的检测,测定值明显偏高。2.3FCR染色法也叫荧光染料反映法,其基本原理是荧光染料本身不产生荧光,无极性,并能自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后,即被醋酶作用形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素。由于荧光素不能自由地出人原生质膜,而只在细胞内积累,因此能够根据花粉产生荧光的状况来判断花粉的生活。国内这首先的研究较少,左丹丹[33]等在总结植物花粉生活力检测办法中,得出FCR法不适合芜菁芸苔属花粉生活力、橡树花粉生活力及迷迭香花粉活力的测定。2.4FDA染色法是荧光反映法的一种,使用的荧光素为二醋酸酯,原理[1]与FCR法相似。操作方式为:(1配制FDA母液:将2mgFD人溶于1ml的丙酮中作为保存液,贮藏在冰箱中备用。(2配制FDA使用液:使用前将FDA母液用一定浓度的蔗糖液稀释至O.01%,蔗糖浓度决定于供试花粉本身规定的渗入压浓度,可预先实验拟定一种不使花粉爆裂的最低浓度,0.5M的蔗糖浓度对许多花粉是适宜的。(3将鉴定的花粉泡浸在FDA液中,(可用凹玻璃片,在开始1小时内,对生活的花粉,荧光强度随着时间直线增加。普通抱浸15-20分钟。(4染色至足够的时间后,用FDA液封片。(5镜检:在荧光显微镜下,以短蓝光适宜〔激发光滤片用B(IF-490、双分色镜用B,阻挡光滤片用0530是适宜的〕。生活的花粉发出黄绿色的荧光,无生活力的花粉无荧光。生活力弱的花粉荧光弱。可用物理或化学的办法杀死的花粉作对照。许利彩[16]等曾用无机酸测西葫芦的花粉活力,得出的结论是该法不适合西葫芦花粉的检测。赵元杰研究[37]成果表明,FDA染色法法用于芒花粉初始生活力测定的成果与花粉离体萌发法的测定成果是基本一致的,此办法的分析环节简朴,效率高,合用于花粉初始生活力的大规模普查分析,但不适宜作为跟踪测定芒花粉生活力变化的办法。2.5其它办法2.5.1P-苯二胺法[38]其基本原理是,通过检测一种新的过氧化物酶的存在与否来判断花粉生活力,有活力的花粉普通被完全染成黑色。具体操作为:(1染液的配制和保存:把一小管过氧化物酶批示剂((涉及25mgp-苯二胺双盐酸和50mg邻苯二酚,Sigma390-1和200μl3%的H2O2(用pH7.4的磷酸缓冲液配制,加入到37℃预热的50ml稀释的Trizmal6.3缓冲液中(用Trizmal6.3浓缩液和去离子水1∶9混合。染液在冰箱中能保存15~20d,这期间若发现染液颜色由浅棕色变为深棕色或黑色,阐明染液已失效。(2测定时,取少量37℃预热的染液滴到待测的花粉样品上,10~15分钟后观察,如果花粉变黑,阐明花粉具生活力。2.5.2孔雀绿一酸性品红一桔红G混合试剂染色法该混合试剂将有活力的花粉染成红色,无活力的花粉为绿色,在实验中将少量花粉埋入染色剂中,保持湿度,在室温放置7—8h,再镜检[39]。该办法曾用在牡丹[40]、百合[39]花粉活力的检测上,但成果都偏高,随着牡丹花粉贮藏时间的推移花粉活力并没有明显的变化,甚至80℃高温解决,染色率也没有明显下降。3萌发测定法3.1离体萌发法花粉离体萌发测定花粉的活力是普遍用到的办法,检测效果最为精确,广泛地应用于多个植物中。取适量的花粉散在培养基上,在25℃气温下培养一段时间,然后再显微镜下观察花粉的萌发,一花粉管不不大于或等于花粉直径为标精拟定花粉的活力。惯用的培养基有业态和固态两种,固态培养基就是多加了琼脂,其它的成分同样。培养基的基本成分为蔗糖和硼酸,蔗糖的作用是提供渗入压和花粉管萌发时所需的能量,浓度根据不同的植物而不同,普通为10%~20%,山楂最适宜的蔗糖浓度为10%[41],桉树的最适宜浓度是20%[42],风信子的最浓度为15%[43]。硼酸的作用是增进花粉管的萌发,浓度不同的植物也差别较大,木麻黄的适宜硼酸浓度为250mg.kg-1[46],金银花[47]、仙客来[48]以0.01%硼酸浓度最佳,茄子则以10mg.L为适宜浓度[49]。固体培养基的组合中,对不同植物来说是不同,适合桉树花粉萌发的最佳培养基为20%蔗糖+6%琼脂+0.01%[42];茄子适宜的培养基为O.5%琼脂+5%蔗糖+硼酸lOmg·L-1[49];客来花粉在10%蔗糖+O.Ol%硼酸+l%琼脂的培养基上萌发率最高[48]。二细胞型花粉,普通在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可萌发,但三细胞型的花粉则需加入其它的元素才干促使花粉更加好地萌发,如十字花科、菊科、禾本科。在基本培养基中加入PEG(聚乙二烯明显提高花粉的萌发率[50]。代光明在研究菊花花粉离体萌发的培养基时,在基本培养基上加入Ca和PEG时,花粉的萌发率也得到明显地提高[51]。3.2活体萌发测定法基本原理是[52],含有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上,并且不会被漂洗掉,因此能够通过漂洗柱头和比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率。操作过程为:(1将待测花粉人工授粉于柱头上,确保花粉与柱头充足接触,并把授粉的柱头与外界隔离以免被污染。(2一段时间后(以具体物种而定,将柱头取下并小心置于1%的醋酸结晶紫水溶液内。此环节的目的是使花粉的外壁着上深紫色以易于与浅色的柱头区别开来。(3用解剖镜对指定柱头上的花粉粒记数。(4将该柱头用水漂洗几次后,再对其上剩余的花粉粒记数。根据公式漂洗后花粉粒数目/漂洗前花粉粒数目×100%可得出萌发率。与其它办法比较，此办法最为直接可靠，王金祥、陈良碧[53]在研究本科植物花粉活力是时就用了此办法。但是只适合于感受性柱头，并且柱头的表面性质对所测的试样也有限制，测得结果偏低。4田间授粉检测法基本原理[54]是根据果实和种子的形成状况来判断花粉生活力。将新鲜花粉与贮藏的花粉同时授给有关的植物，观察并比较贮藏前后的结实率。孙文耕[54]在李花粉贮藏性与授粉效果的研究中，得出田间授粉的坐果率较低，新制的花粉的做过滤与贮藏的花粉存在明显差别。张照坤[55]用田间授粉得出紫薇划分的生活力，同时也验证长短雄蕊的花药都含有使雌蕊受精的能力。该办法较为精确和可靠，不仅能够得出花粉的活力，并且还能够判断出柱头可授性，但是其费时费力，不利于生产，并且还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响，测定成果明显其它办法[54,55]。5形态测定法形态测定法的基本原理是根据花粉本身的形状来判断花粉生活力。该法即使简朴，但测定有活力的花粉与实际值相差太大，且重复之间相差也比较明显，普通不采用。苗青[56]等观察文冠果的花粉形态得出，可与花粉和败育花粉的大小相称，表面都有大小不等的疣状突起，萌发沟内有复饰物，如莲花状，不同的是可育花粉极面观可见3个萌发沟，贯穿两极，为圆形，而败育花粉的表面有凹陷，萌发沟之间有压痕。6无机酸检测法也称瞬时花粉管法，基本原理是，由于酸对花粉粒质膜的刺激作用，使质膜变得非常脆弱，通透性也增大，以致大量地吸取H+，使内压快速升高并造成质膜膨胀，最后活性花粉的胞质内含物就会喷射而出，形成“瞬时花粉管”。此法首选的无机酸为硝酸，38,52]38,52另首先是硫酸，硝酸的抱负浓度为0.8mol/L，硫酸的浓度为14.4%[38,52。该办法是在体外产生花粉管，但不是真正的花粉管。用该法检查花粉的活力时，在解决好后5到10min观察有活力的花粉。因花粉吸水后，萌发孔也会膨胀，因此不以判断与否含有活力，所以极少用无机酸检测花粉活力，周莉花等用此办法检测腊梅花粉的活力得到同样的结论[57]，阐明无机酸法不适合腊梅花粉活力的检测。汪妮等[58]在研究韭菜花粉测定办法及袁德义等[59]研究比较油茶花粉生活力检测办法时，也因花粉吸水后也能观察到萌发孔膨胀外突的现象，而认为无机酸不适合这两种植物花粉生活力的测定。杨秀莲等[60]用此法检测桂花花粉的活力时，没有花粉管的萌发，因此此法也不适宜用于桂花花粉活力的检测。7总结总体上，染色法简朴、快速能够在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉的特性影响较大，不能直接体现出花粉的萌发率。因此，不同植物用不同适宜的染色法来检测花粉的活力。发芽测定法是最靠近花粉的实际活力，并且观察指标明显，易于分辨花粉的活力，在实际应用中以该法最多。用离体培养法测定花粉活力时，需要注意的是，不同植物的花粉对培养基的配方不同，某些植物还需要在基本的培养基中加入除硼以外616163]的矿质元素及其它的物质，花粉才干够更加好地萌发[61-63。田间授粉法即使与实际生产最为靠近，反映最后的结实率，但其时间周期长，工作量大，而其易受到天气条件、时间地点的影响，且不利于生产，该法在实际应用中极少采用。形态鉴定法即使简朴，但测得值与实际花粉活力相差太大，各重复间也存在着较大差别，也极少采用。无机酸法是靠通过无机酸解决后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来来判断花粉与否有活力，但花粉吸水后也会出现此现象，采用无机酸不判断花粉与否真正含有活力。参考文献[1]胡适宜.植物胚胎学实验办法(一花粉生活力的测定[J].植物学通报.1993.10(2[2]凌春英,肖恩,严冬瑾等.大花蕙兰和墨兰花粉活力测定及贮藏研究[J].安徽农业科学..38(5[3]程伟.西南桦花期物候、生殖构件和花粉特性的研究[D].广西大学.25-28[4]胡君艳,李云,孙宇涵.银杏花粉生活力测定及贮藏办法的优化[J].中国农学通报..24(5[5]魏佳.百莲子属五个品种开花生物学特性的研究[D].东北林业大学.20-22[6]盛金.西葫芦不同自交系低温下花粉活力与耐冷性的关系[D].山东农业大学.20-22[7]梁守翠,漆燕玲,李玉萍等.当归开花授粉特性和繁育系统的研究[J].农业科学通讯..8[8]孙德权.番木瓜花粉生活力及其贮藏性研究[J].福建果树..2[9]铁军,金山.,茹文明等.连翘花粉活力和柱头可授性研究[J].山西大学学报..31(4[10]文亚峰,谢碧霞,潘晓芳.人心果花粉育性的研究[J].江西农业大学学报..30(3[11]胡国富,李成雁,袁强等.一串红Salvia+splendens+KerGawl花粉活性研究[J].安徽农业科学..36(30[12]王其刚,张颢,蹇洪英等.月季云粉、云玫的花粉活力和柱头可授性研究[J].江西农业大学学报,32(3[13]张妍,杨发君,田义新.穿龙薯蓣花粉活力及柱头可授性测定办法研[J].安徽农业科学．.38(5[14]杨发君,张妍,张建等.防风花粉活力测定办法的比较及柱头可授性的研究[J].人参研究..2[15]郭庆,王德斌,王定康等.海棠藤花粉活力的测定办法比较[J].昆明学院学报.,31(3[16]许利彩,李海真,沈火林.西葫芦花粉生活力测定办法及最佳授粉时间的研究[J].河南农业科学..8[17]邢虎成.揭雨成.周清明等.苎麻花粉生活力测定办法的研究[J].中国农学通报.,26(17[18]许玉凤,韩静,海风等.鸢尾属植物花粉活力和柱头可授性的研究[J]北方园艺.16[19]林玉虹,陈显国,周少霞等.澳洲坚果花粉活力与柱头可授性研究[J].中国热带农业..3[20]武枯,刘霞,张光星.不同温度对胡萝卜花粉活力的影响[J].华北农学报..25(24[21]李飞,李标,孙伟等.马铃薯亲本的花粉活力研究初报[J]贵州农业科学..37(12[22]赵宏波,陈发棣,房伟民等.菊属植物花粉生活力检测办法的比较[J].浙江林学院学报..4(9[23]秦贺兰,贾宗锴,闫东艳.南非万寿菊温室栽培花粉活力和柱头可授性研究[J]河北林业科技..3[24]王艳哲,崔彦宏,张丽华等.玉米花粉活力测定办法的比较研究[J].玉米科学..18(3[25]林树燕,丁雨龙.刚竹属3个竹种的开花生物学特性[J].林业科学开发..21(5[26]张彬,芮雯奕,郑建初等.水稻开花期花粉活力和结实率对高温的响应特性[J]作物学报..33(7[27]姜华,毕玉芬.紫花首蓿花粉活力和柱头可授性的研究[J].草业科学..26(9[28]严峥.影响辣椒花粉活力和结实率的光温条件[D]湖南农业大学.14-17[29]王苗苗,唐灿明.高温胁迫后的棉花花粉活力测定办法[J]江苏农业学报,,26(2[30]红雨,方海涛,那仁.濒危植物蒙古扁桃花粉活力和柱头可授性研究[J].广西植物..26(6[31]王旭军,吴际友,程勇.台湾恺木花粉生活力测定办法初探[J].浙江林业科技..27(5[32]廖康,李会芳,许正.野生樱桃李花粉活力与授粉结实特性初报[J]新疆农业科学..45(3[33]左丹丹,明军,刘春等.植物花粉生活力检测技术进展[J].安徽农业科学..35(16[34]蒲高忠,潘玉梅,林春蕊等.桂林唇柱苣苔和百寿唇柱苣苔的开花动态及花粉活力和柱头可授性的比较[J].广西植物..28(3[35]刘拂晓,刘萍,梁凤丽等.新疆野杏花部综合特性与繁育系统初步研究[J].新疆农业科学.47(4[36]姜雪婷,杜玉虎,张绍铃等.梨43个品种花粉生活力及4种测定办法的比较[J].果树学报.,23(2[37]赵元杰.芒繁育体系的研究[D].湖南农业大学.34-35[38]王钦丽,卢龙斗,吴小琴.花粉的保存及其生活力测定[J].植物学通报.,19(3[39]刘春,穆鼎,明军.百合种间杂交受精前障碍的研究[J].园艺学报.,33(3[40]玉国,张延国,周番等.牡丹花粉贮藏与活力检测[J].[41]王玉霞,王颖,李芳东等.不同种仁率山楂品种花粉量及花粉活力的测[J].山东农业科学,2[42]王伟,徐建民,陆钊华等.不同贮藏方式