水环境卫生细菌学检测-大肠菌群检验

大肠菌群检验教学内容1.大肠菌群检验原理；2.大肠菌群检验的程序；3.检测各环节操作规范。教学目标（1）知识目标大肠菌群的性状特征；多管发酵法检验原理；检验各环节的特征性表现。（2）技能目标掌握大肠菌群检验的总体程序；掌握乳糖发酵检验的操作技能；掌握伊红美蓝平板检验的操作技能；掌握检验结果报告的方法。（3）素质态度要求

态度端正，积极主动学习，严守操作规范，团结协作。一、大肠菌群检验原理与程序

大肠菌群是水体粪便污染的指示菌。天然水体的细菌性污染主要源于生活污水中的粪便，其中可能病原菌种类很多，而大肠菌群是数量最大的，可以用作水体粪便污染状况的指示菌。大肠菌群的类别特征：37℃24~48h能利用乳糖产酸产气，好氧和兼性厌氧，Ｇ-，无芽胞。能在伊红美蓝培养基上产生特征性菌落：有核心，带金属光泽，深紫色；深黑色、不带或略带金属光泽；淡紫红色、中心较深。检验程序：

乳糖发酵检验伊红美蓝平板分离检验

革兰氏染色准备工作：（1）制备培养基

乳糖蛋白胨培养液：

成分：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、水1000ml，溴甲酚紫乙醇液（16g/L）1ml。

制法：调pH7.2~7.4后加入溴甲酚紫乙醇液，分装于装有倒管的试管中（每管10ml）。115℃20min。

二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：除水外加倍。伊红美蓝培养基：

成分：蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20g、水1000ml，乳糖10g；伊红水溶液（20g/L）20ml、美蓝水溶液（5g/L）13ml。

制法：调pH7.2后加入乳糖，115℃20min。倒平板前加入伊红美蓝。制备无菌生理盐水。（2）培养皿、试管、移液管等玻璃器皿的灭菌；

生活饮用水——原始水样，接种10ml到双料液中（或加1个10倍无菌生理盐水稀释液，接种1ml到单料液中）。

出厂自来水——原始水样接种10ml到双料液中，1ml10倍无菌生理盐水稀释液接种到单料液中。

水源水——10倍无菌生理盐水递交稀释到10－3，3浓度各1ml接种到单料液中；污染严重可加大稀释度。每个样品接种均为5重复。二、乳糖发酵检验

36℃培养24h。产酸（变黄色）产气者报告为乳糖检验阳性，进入下一步检测。二、乳糖发酵检验取发酵液接种到伊红美蓝培养基平板（划线分离），36℃培养24h。具备下列大肠菌群典型菌落特征的为阳性管：

有核心，带金属光泽，深紫色；

深黑色、不带或略带金属光泽；

淡紫红色、中心较深。三、伊红美蓝平板分离检验大肠菌群Ｇ-或复发酵（乳糖蛋白胨培养液培养）产酸产气。四、革兰氏染色检验经过前面三个环节的检验，得到证实的各稀释度的大肠菌群阳性管数；查阅总大肠菌群MPN检索表，得到MPN/100ml值；再乘以测定3稀释度中的最小稀释倍数，报告数值；如果所有乳糖发酵管均为阴性，则报告未检出。五、MPN检索报告六、任务考核考核内容考核指标分值培养基制作是否规范25乳糖发酵无菌操作、整个过程操作的规范性20平板分离培养划线方法、取菌前后的操作规范、划线操作规范20革兰氏染色是否熟练、规范，判断是否准确15数量检索与报告方法是否正确20大肠埃希氏菌检验教学内容1.大肠埃希氏菌的性状特点；2.检测各环节操作规范。教学目标（1）知识目标大肠埃希氏菌的性状特征；多管发酵法检验原理；检验各环节的特征性表现。（2）技能目标掌握大肠埃希氏菌检验的总体程序；进一步掌握乳糖发酵、伊红美蓝平板检验、结果报告等环节的操作技能。（3）素质态度要求

态度端正，积极主动学习，严守操作规范，团结协作。一、关于大肠埃希氏菌

大肠埃希氏菌是指能产生β－半乳糖苷酶分解ONPG使培养基呈黄色，能产生β－葡萄糖醛酸酶分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。

根据大肠埃希氏菌（大肠杆菌）不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：肠致病性大肠杆菌（EPEC）肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）肠黏附性大肠杆菌（EAEC）弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)

相对于大肠菌群、耐热大肠菌等微生物，只有大肠埃希氏菌是粪源特异性的，是最准确和专一的粪便污染指示菌。检样乳糖发酵EC-MUG培养基管培养结果报告二、检验程序紫外荧光检验准备工作：

1．培养基：

乳糖蛋白胨液体培养基（同大肠菌群检验）

EC-MUG培养基：

胰蛋白胨20g、乳糖5g、3号胆盐或混合胆盐1.5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、4－甲基伞形酮－β－D－葡萄糖醛酸苷（MUG）0.05g，pH6.9。

分装试管中，115℃20min。

2．无菌玻璃器皿等用具。操作要求：

EC-MUG结果观察：

将EC-MUG培养基管在暗处用波长为366nm紫外灯照射，有蓝色荧光的为阳性