酒精对小鼠睾丸内源性细胞增殖及凋亡的影响

酒精对小鼠睾丸内源性细胞增殖及凋亡的影响

在日常生活中，饮酒是一种非常常见的现象。长期饮酒会导致各种疾病。文献报道酒精对男性生殖器官的损伤是导致出生缺陷的重要原因之一。刘长云等研究了白酒对大鼠睾丸的损伤作用,结果表明随着饮酒量的加大和饮酒时间的延长,睾丸的相对重量降低,生精小管萎缩变细,睾丸间质增大,精子活力显著降低,精子畸形率增高明显,血清LH、FSH及睾酮均比正常水平低。酒精对睾丸组织中一氧化氮合酶(eNOS)、增殖细胞核抗原(prliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表达和细胞凋亡影响的研究,报道很少。本研究以22d龄小鼠为实验对象,用5%、10%和15%酒精水溶液饲饮小鼠,观察酒精对小鼠睾丸组织结构、eNOS和PCNA表达及细胞凋亡的影响。材料和方法1.调查组的确定选用21d龄昆明种雄性小白鼠34只(由河北医科大学动物中心提供),平均体重12g,随机分成正常对照组(10只)、5%酒精实验组(8只)、10%酒精实验组(8只)、15%酒精实验组(8只)。从22d龄幼鼠开始同时饲饮不同浓度的酒精水溶液,酒精由天津北方化学玻璃购物中心出产(无水乙醇,分析纯,含甲醇0.05%),用自来水配制而成,对照组饲饮自来水,每日更换新溶液,连续饲饮60d后处死。2.蛋白甘油经皮片组动物称重断头处死后,剖取左侧睾丸,固定于4%的多聚甲醛,常规脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋,制成6μm厚的连续切片,切片裱于覆有蛋白甘油的载玻片上,切片经二甲苯脱蜡后梯度酒精复水,苏木精染色5min,经1%盐酸酒精分色,自来水充分冲洗蓝化后,再用0.1%伊红复染5min,最后经梯度酒精脱水,二甲苯透明后封片。3.免疫组织化学取右侧睾丸固定于4%的多聚甲醛溶液1h后,置入30%的蔗糖缓冲液4℃冰箱过夜,用ReichertHistoSTATD冰冻切片机制成6μm厚的连续切片,每隔2张取1张,裱于覆有明胶的载玻片上。冰冻切片以ABC法进行免疫组织化学染色,SP试剂盒由北京中山公司提供的美国Zymed公司产品。切片经1%甲醇-过氧化氢处理30min,封闭血清于37℃处理30min,加入eNOS(1∶50Santacruz)抗体和PCNA抗体(1∶50Zymed)于4℃冰箱过夜,再加入生物素标记的二抗,37℃处理30min,加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育30min,经DAB-H2O2显色3～5min,经PBS充分冲洗,eNOS切片经苏木素复染1～3min,流水充分冲洗后干燥、脱水、透明、中性树胶封片,光镜观察。4.免疫、抗地高辛抗体tb和抗-4-dig-utpdab的制备用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,原位细胞凋亡检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司,过程按使用说明书。石蜡切片经常规脱蜡入水;新鲜配制的3%过氧化氢液室温孵育15min;TBS1∶100新鲜稀释蛋白酶K37℃消化15min;每片加标记缓冲液(labelingbuffer,LB)20μl,室温30min;再加TDT、DIG-UTP、LB的混合液,4℃冰箱过夜;每片加封闭液50μl,室温30min;每片加生物素化抗地高辛抗体50μl,37℃反应60min;TBS1∶100稀释SABC加至切片,37℃45min;DAB显色20min;蒸馏水冲洗,脱水、透明、封片。阴性对照,用0.01mol/LPBS代替TDT、DIG-d-UTP、LB混合液标记液,其他步骤同上。5.精小管及精密度切片用病理图像分析系统(北京航天航空大学设计)采集图像,每组随机选取3张切片,每张切片检查10个视野。利用电脑图像分析系统的体视学功能测量生精小管的直径;利用电脑图像分析系统的组织化学分析功能统计eNOS阳性细胞的面积密度、单位面积内PCNA阳性细胞的数目及凋亡细胞数目。统计数据用excel作图表,statistica软件进行单因素方差分析及组间t检验,根据均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)绘制统计图。结果1.各组生精管管路的变化正常组小鼠生精小管管腔明显,生精细胞在管内排列紧密有序,可见精子生成(图1);5%酒精组与正常组无明显差异;10%酒精组生精小管管径变小,排列变得疏松,生精小管周围间隙加宽(图2);15%酒精组生精小管萎缩变细,管径明显变小,生精小管周围间隙进一步加大,有些生精小管内生精细胞排列变得疏松,生精细胞间出现空隙(图3)。2.酒精浓度对睾丸精原细胞及pcna表达的影响eNOS免疫组织化学反应阳性细胞内可见阳性颗粒,呈浅黄色至棕黄色,大小均一,位于胞膜内的胞浆中。正常组小鼠睾丸内血管内皮细胞、间质细胞及精子细胞呈明显的eNOS阳性反应,胞质为黄色(图4);随着酒精浓度的增大,eNOS阳性细胞显色加深,15%酒精组睾丸内阳性细胞显色为深棕色,数目明显增多(图5),但各组的精原细胞及精母细胞均呈阴性反应。PCNA免疫反应阳性细胞,其阳性反应颗粒为浅棕色至深棕色,颗粒大小一致,位于胞核内。正常组部分精原细胞呈阳性表达(图6);5%酒精组PCNA表达与正常组无明显差异,阳性细胞数目略有增加;10%酒精组PCNA阳性细胞数目比5%酒精组略有增加;15%酒精组睾丸内精原细胞呈强阳性表达(图7),阳性细胞数目明显增多。3.组凋亡细胞表达情况正常组小鼠睾丸的生精小管内精原细胞、初级精母细胞阳性表达比较多见(图8);5%酒精组凋亡细胞表达比正常组显著增多(图9);10%酒精组凋亡的生精细胞数目持续增加(图10);15%酒精组睾丸内阳性表达的生精细胞显著增多,凋亡细胞为强阳性深染,生精小管内可见阳性的精原细胞与初级精母细胞(图11)。4.酒精浓度对enos阳性细胞面积密度和pcna免疫反应的影响图像分析及统计结果表明:随着酒精浓度的增大,小鼠睾丸内生精小管的直径呈减小趋势(附表),10%酒精组生精小管直径与5%酒精组差异极显著(P<0.01),15%酒精组生精小管直径与10%酒精组差异极显著(P<0.01)。随着酒精浓度的增大,eNOS阳性细胞面积密度呈增大趋势(附表),15%酒精组与其他组差异极显著(P<0.01)。随着酒精浓度的增大,单位面积内PCNA免疫反应阳性细胞数目呈增大趋势(附表),15%酒精组与其他组差异极显著(P<0.01)。随着酒精浓度的增大,单位面积内凋亡细胞数目呈增大趋势(附表),15%酒精组与其他组差异极显著(P<0.01)。小鼠睾丸中低度酒精的组织结构本实验将小鼠分为正常对照组、5%酒精组、10%酒精组和15%酒精组4组,较系统地研究了低度酒精对小鼠睾丸组织结构、eNOS、PCNA表达和生精细胞凋亡的影响,现讨论分析如下:1.酒精损伤作用通过实验观察和统计分析,我们发现随着酒精浓度的增大,生精小管周围间隙加宽,睾丸生精小管直径呈减小趋势,高浓度酒精可使生精小管内生精细胞间出现空隙,表明酒精对生殖细胞有明显的损伤作用,这与文献报道结果是一致的。许多研究证实随着饮酒量增加及饮酒时间延长会造成生精小管萎缩,精子的活力降低,精子密度减少且精子的畸形率升高,同时血清性激素(LH,FSH,T)水平降低,提示酒精有抑制性激素分泌的作用,这可能是导致个体生殖能力下降甚至不育的重要原因。2.影响男性生殖能力的因素许多研究证实NO能调节睾丸的血液供应、激素的合理分泌、精子的正常发生及获能,并影响精子的质量,从而影响雄性的生殖能力。在实验观察中我们发现,酒精影响小鼠睾丸阳性eNOS的表达,并随着酒精浓度的增大,睾丸内eNOS表达增多,促使睾丸产生的NO增多,进而可能会抑制激素的分泌及精子的发育,但有关酒精与NO之间的关系,目前尚未见报道,酒精对精子发生和雄性激素分泌的作用机理尚需进行深入地探讨。3.酒精影响睾丸生精细胞增殖和凋亡的作用雄性生殖细胞在发育过程中不断分化、增殖的同时伴有生精细胞的凋亡产生,许多生殖疾病过程都与生精细胞的凋亡变化有关。正常生理状态下的生精细胞凋亡是机体清除增生过程中染色体复制发生致命错误或恶变的细胞,使生精细胞数量保持相对稳定。Ewald等研究发现,酒精的直接作用导致胸腺萎缩,并且0.2%到0.8%酒精组胸腺细胞凋亡明显增加。酒精对生精细胞凋亡的影响文献报道很少,我们研究发现,酒精有影响睾丸生精细胞增殖与凋亡的作用,并随着酒精浓度的增大,增殖与凋亡细胞显著增多。周宏等认为,精子发生过程中对生殖细胞增殖-凋亡平衡的调节具有相关的调控因素。Blanco的有关研究还证明,生精细胞成熟过程中的凋亡变化与机体内分泌变化有关。值得注意的是细胞增殖的数目在15%酒精组出现显著增多,而凋亡细胞的数目在5%酒精组开始显著增多,显然低度酒精促进小鼠生精细胞的增殖与凋亡。10%酒精组与15%酒精组凋亡细胞数目持续显著增多,表明酒精的浓度增大可能导致产生的脂质过氧化物和自由基增多,促使细胞凋亡加快,对雄性的生殖能力造成有害影响。有研究认为,酒精的过氧化反应使强氧化剂和抗氧化剂之间的平衡作用失调。抗氧化作用包括细胞内与细胞外的多种营养物质的保护作用