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文档简介
虫草素对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响
草地昆虫素是牧草最重要的生理活性成分。传统医学认为:冬虫夏草性平味甘,入肺、肾二经,“肺与大肠相表里”。研究显示北冬虫夏草具有提高免疫力和抗肿瘤的作用。但是冬虫夏草的主要有效成分虫草素是否同样具有预防和治疗结肠癌的作用及其作用机制引起广泛关注。本研究运用血清药理学的方法,给BALB/c裸鼠分别喂饲虫草素或同体积生理盐水后处死取血清,将各组血清分别或联合顺铂在体外与人结肠癌细胞株SW1116共培养,研究虫草素对结肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响,及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。材料和方法一、动物房标准饲养6~8周龄大BALB/c雌性裸鼠,体重20g左右,由中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所动物房提供,在复旦大学上海医学院动物房SPF条件下标准饲养。人结肠癌细胞株SW1116由上海消化外科研究所保留传代。二、细胞毒性检测虫草素(北冬虫夏草提取)由中国国宝生物研究所提供,生产批号:20090201;RPMI1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司);顺铂(齐鲁制药有限公司);CCK-8细胞増殖/细胞毒性分析试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);Hoechst33258荧光检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);Safire2型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司);U-SPT荧光显微镜(Olympus,日本);H-500透射电子显微镜(Hitachi,日本);BDCalibur流式细胞仪(BDBiosciences,美国)。三、连续给药4d剂量l选用6~8周龄BALB/c雌性裸鼠20只。随机分为虫草素组和空白对照组,每组10只。虫草素组:按1000mg·kg-1·d-1的量,每日喂饲虫草素配制液0.3ml(每0.3ml含20mg虫草素);空白对照组:每日喂饲生理盐水0.3ml。各组裸鼠连续喂饲3d,末次给药后1h处死小鼠取血。为避免溶血,将每只小鼠血液分别离心取上层血清后,再将同组血清混合,-80℃保存备用。四、组和处理1.组取处于对数生长期的SW1116肿瘤细胞,随机分为四组:虫草素组、化疗组、虫草素+化疗组、空白对照组。2.增设保养剂为抗菌素联合化疗组edta的细胞培养CCK-8试剂盒以一种新的四唑盐为底物,经细胞代谢产生水溶性甲瓒产物,可直接用酶标仪检测450nm和630nm吸光度值(OD值),OD值与活细胞数量成正比。取处于对数生长期的SW1116肿瘤细胞,用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化后计数,以100μl/孔(5000个细胞)接种于96孔培养板,各组分别加入下列处理因素:(1)虫草素组:将喂饲虫草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.001mg+空白对照组血清10份混合后的1/200的量(0.1μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将喂饲虫草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119μl)+顺铂0.001mg加入该组肿瘤细胞;(4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/200的量(0.1μl)加入该组肿瘤细胞。上述各组加样后将96孔培养板放入CO2培养箱培养。分别在培养0h、24h、48h、72h、96h、120h后,以CCK-8法检测细胞增殖抑制作用。3.细胞培养和样品前处理肿瘤细胞悬液制备:各组细胞弃去原培养液,无菌PBS液洗涤以充分除去死亡细胞,以新鲜的无血清培养液重悬细胞并计数,调整细胞悬液的浓度至5×105个细胞/ml。分别加入下列各处理因素:(1)虫草素组:将虫草素组10份血清混合后取1/100的量(0.238μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.002mg+空白对照组血清10份混合后的1/100的量(0.2μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将虫草素组10份血清混合后取1/100的量(0.238μl)+顺铂0.002mg加入该组肿瘤细胞;(4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/100的量(0.2μl)加入该组肿瘤细胞。每组细胞200μl(1×105个细胞/孔)加入Transwell小室的上室,下室中加入600μl含10%小牛血清的RPMI1640培养液。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h。弃去上室中的培养液,取出小室,吸弃上室液体,用棉签仔细擦净膜上未迁移的细胞,取下上室底部的膜。37℃预温的PBS液漂洗两次,4%多聚甲醛固定,Giemsa染液染色。显微镜200×视野下任取6个不重复视野,拍照计数。以上实验重复2次。4.肿瘤细胞染色体畸变试验各组细胞弃去原培养液,以每孔4×105个细胞铺入6孔板,如下加样:(1)虫草素组:将虫草素组10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.08mg+空白对照组血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将虫草素组10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)+顺铂0.08mg加入该组肿瘤细胞;(4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入该组肿瘤细胞。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学发生改变,分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。凋亡细胞在荧光显微镜下显示为亮蓝色细胞,而正常细胞为暗蓝色。5.流式细胞仪检测结果SW1116肿瘤细胞以500μl/孔(4×105个细胞)接种于6孔培养板。如下加样:(1)虫草素组:将虫草素组10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.08mg+空白对照组血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将虫草素组10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)+顺铂0.08mg加入该组肿瘤细胞;(4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入该组肿瘤细胞。流式细胞仪检测结果判断标准如下:正常的活细胞不被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色;早期凋亡细胞仅被AnnexinV-FITC染色,碘化丙啶染色呈阴性;凋亡晚期细胞可以同时被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色;坏死细胞仅被碘化丙啶染色,AnnexinV-FITC染色呈阴性。重复3次,取均数,统计细胞凋亡率。五、统计学方法数据采用均数±标准差(ˉx±s)表示,两组间差异比较采用t检验,多组间差异采用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验,统计分析由SPSS11.5统计软件包完成,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果一、烟草素和化疗组各刑罚执行指标比较处理后四组细胞OD值和生长曲线见图1,表1。处理24h后,虫草素组OD值小于空白对照组(P=0.01);化疗组OD值小于空白对照组(P=0.01),虫草素+化疗组OD值小于其余三组(与虫草素组比较P=0.01,与化疗组比较P=0.03,与空白对照组比较P<0.01)。处理48h及72h后,虫草素+化疗组和化疗组OD值均低于其余两组,但该两组相互之间差异无统计学意义(48h:P=0.30,72h:P=0.14);虫草素组OD值均小于空白对照组。处理96h后,虫草素+化疗组OD值小于其余三组(与化疗组比较P=0.02,与虫草素组和空白对照组比较均为P<0.01);化疗组OD值小于虫草素组;虫草素组OD值小于空白对照组。以上差异均有统计学意义。处理120h后,虫草素+化疗组OD值小于其余三组(与化疗组比较P=0.02,与虫草素组和空白对照组比较均为P<0.01);化疗组OD值小于虫草素组;虫草素组OD值小于空白对照组。以上差异均有统计学意义。二、迁移细胞数的比较处理后四组细胞(×200不同视野下)细胞数见图2~5。迁移实验统计学分析结果(表2):虫草素+化疗组发生迁移细胞数为(38.17±4.41)个,少于其余三组;化疗组发生迁移细胞数为(66.58±6.43)个,少于虫草素组和空白对照组;虫草素组发生迁移细胞数为(116.83±6.74)个,少于空白对照组。以上差异均有统计学意义(F=91.04,P<0.01)。三、细胞肺癌试验的结果1.凋细胞改变Hoechst33258荧光染色可将正常细胞、凋亡细胞区别开来。荧光显微镜下(图6~9)可见典型的凋亡细胞改变,细胞呈亮蓝色,早期有体积缩小、月牙形细胞核等改变,晚期可见核碎裂等。实验结果提示:除空白对照组外,其余三组均可见大量呈亮蓝色的凋亡细胞,其中虫草素+化疗组与其余三组相比,可见更多凋亡细胞。2.各组细胞凋亡率四组细胞经不同处理后,结果显示虫草素+化疗组细胞凋亡率[(28.10±4.21)%]高于其余三组细胞凋亡率[虫草素组:(16.19±5.65)%,化疗组:(14.90±3.56)%,空白对照组:(6.83±1.65)%],差异有统计学意义(P<0.05)。而其余三组之间两两比较,差异均无统计学意义。讨论一、活性成分对体外实验的作用近年来,结肠恶性肿瘤的发病率与死亡率呈上升趋势,欧美国家结直肠癌的发病率位列恶性肿瘤的第二位,在我国为第四位。据2005年上海统计,结直肠癌的发病率已高居恶性肿瘤的第二位。手术仍是目前治疗结直肠肿瘤的主要手段。但近30年来疗效提高并不显著。由于大部分结直肠恶性肿瘤患者在临床确诊时已伴有腹膜转移或其他重要脏器的微转移,单靠扩大切除范围难以改善预后。临床常采用术后辅助化疗为主的综合治疗方案,间或加用物理治疗、靶向药物和中药,但中晚期患者的术后无瘤生存率和总生存率仍不令人满意。约有50%的患者死于术后肿瘤的复发和转移。因此,有必要探寻新型辅助药物以提高结直肠癌疗效,改善预后。冬虫夏草是我国的珍稀药材,其具有提高免疫力和抗肿瘤的作用。现代医学研究显示:冬虫夏草中最主要的生理活性成分为虫草素和虫草多糖(CP)。有研究显示CP可以通过激活宿主免疫反应而发挥抗肿瘤作用。另有研究显示虫草素和CP能够促进人扁桃体及小鼠T-淋巴细胞的增殖,并且能够促进环磷酰胺(CY)抑制鼠脾活化T细胞增殖;在一定浓度下,可以显著升高人扁桃体活化T细胞TNF-β的分泌水平,这对增强机体抗肿瘤免疫功能具有很大的作用。但目前文献报道的体外实验大多将虫草素或CP直接作用于离体细胞,这与临床实际用药以及药物实际作用情况明显不符。一般在临床上患者口服用药后,药物需经消化道吸收、经血液运送到全身各部、再经机体代谢和排泄,因此对肿瘤起治疗作用的成分不一定是药物的原形,它可以是经代谢后的其他产物,也可以是药物在体内经过许多中间环节引导机体产生的其他药理反应,为此我们根据血清药理学的原则设计了本实验:先给裸鼠喂饲虫草素,让药物经消化道进入机体,通过一定的代谢过程,使血液富含药物有效成分,然后提取其血清,在体外将含药血清和(或)联合铂类化疗药物作用于结肠癌SW1116细胞,借以间接观察虫草素对肿瘤细胞增殖、迁移的影响及其诱导细胞凋亡的作用。如此设计似较直接加药法更符合临床实际,更为合理。“血清药理学”的概念和基本原理最早在1988年由日本学者田代真一提出,用于改进以前的不太合理的体外药理实验方法。事实上体外实验是药理的实验研究中不可或缺的手段。其优点是条件可控性强,可在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面的研究,揭示药物机制较为深入,重复性好,使用材料少。但随着研究的深入,某些药物直接加入离体反应体系进行体外实验的研究方法存在很多问题。由于某些药物化学成分复杂,口服后体内要进行一系列的生物转化以发挥药效,而且理化性质复杂,经常造成一些假阴性和假阳性的结果,例如:20世纪50、60年代国内外用肿瘤细胞株在体外过筛数千种植物提取物,报道了上百个阳性结果,但用于体内实验结果大部分为阴性。这促使各国学者不断努力,寻找更好的方法。1984年,在日本召开的第一届和汉医药学会上,日本学者首次提出给动物灌服药物一定时间后,取其血清进行实验的药理学新方法。1988年田代真一正式提出了“血清药理学”这一新概念。此后,血清药理学广泛应用于肿瘤、心血管、消化、免疫等方面的药理学研究中,并与体外实验所见作比较,取得了很大的进展。为此本研究应用血清药理学方法,进行虫草素抗结肠癌的体外实验。二、牧草素联合化疗药物的作用人结肠癌细胞具有增殖快、易于向周围组织浸润及经淋巴道早期转移的特点,这是结肠癌导致患者死亡的重要原因。肿瘤细胞的迁移是造成肿瘤转移的重要因素。有效地抑制肿瘤细胞增殖、减少细胞迁移,可以减少肿瘤转移的发生率。本研究通过CCK-8细胞增殖抑制实验发现,虫草素组血清在作用于结肠癌细胞株SW111624h后出现显著抑制细胞增殖的作用,但对细胞增殖的抑制作用不如传统化疗药物顺铂明
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