不同蛋白源替代饲料中的鱼粉对褐点石斑鱼幼鱼血液生理生化指标的影响

不同蛋白源替代饲料中的鱼粉对褐点石斑鱼幼鱼血液生理生化指标的影响

随着世界水产养殖的快速发展，水产饲料企业对鱼粉的需求急剧增加，但鱼粉资源的逐渐减少，价格急剧上升。因此，寻找能够代表鱼粉而不是所有硫酸人的蛋白质来源是近年来水产饲料行业的研究热点。在保证水产养殖品种正常生长的前提下,以廉价的动植物蛋白原替代鱼粉既可以降低饲料成本,又有助于保护海洋渔业资源。由于血液生理生化参数能够反应鱼类健康状况、营养水平及其对环境的适应性等,是重要的生理、病理和毒理学指标,因而被广泛用作饲料利用效果综合评价的标准之一[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19]。褐点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus),又称棕点石斑鱼,俗称老虎斑、虎头斑,隶属于鲈形目鮨科石斑鱼属(Epinephelus),为暖水岛礁性鱼类,近年来已经成为海南、广东、福建等地海水养殖的重要名优品种之一。褐点石斑鱼配合饲料的配方以及在配合饲料用廉价蛋白源替代鱼粉已有报道,但相关研究主要着眼于实验鱼的生长状况等表观指标,而替代蛋白饲料对实验鱼血液生理等内在指标的影响尚未见报道。本实验用豆粕、玉米蛋白粉和啤酒酵母粉等3种蛋白源替代部分鱼粉制成饲料,研究其对褐点石斑鱼大规格种苗血液生理生化指标的影响,以期为褐点石斑鱼大规格种苗培育及高效配合饲料研制提供依据。1材料和方法1.1饲料原料颗粒制备实验设计5种等氮等能饲料,原料均购自粤海饲料厂,以全鱼粉饲料(D1组)作对照,用豆粕替代10%、20%的鱼粉蛋白(D2、D3组),玉米蛋白粉替代10%的鱼粉蛋白(D4组),啤酒酵母替代10%的鱼粉蛋白(D5组)。饲料原料粉碎过孔径0.212mm的筛,在搅拌器中混匀后加工成直径3.0mm的颗粒,风干,于-20℃下冷藏备用。饲料配方和化学组成见表1。1.2幼鱼的饲养实验褐点石斑鱼幼鱼取自广东海洋大学鱼类研究课题团队自繁自育种苗,从育苗场运回实验室置于数个玻璃钢水槽(100cm×100cm×70cm)用全鱼粉饲料驯养10d,选取规格大小接近的幼鱼(体长9.00±0.63cm,体重22.48±3.83g)共180尾,随机置于各实验水槽中,进行5个饲料组的饲养实验;每组3个平行组,共15个循环水槽,养殖密度12尾/水槽。1.3实验用水及水质养殖实验在60cm×50cm×70cm的玻璃钢水槽内进行,每个水槽水体体积150L,24h充气,每天9:00和15:00定时投喂饵料至饱食。实验用水为经沉淀及沙滤的天然海水,海水盐度27~32,自然光周期及自然水温。采用流水养殖,每天水交换量100%~150%。每天测1次水温,每周测1次水体溶氧和氨氮,水温范围26~32℃,氨氮浓度小于0.5mg/L,溶氧高于5mg/L,pH7.8~8.0,实验历时8周,没有实验鱼死亡。1.4血常规和生化指标检测分别从每个平行组中随机取褐点石斑鱼3尾,用2mL一次性无菌注射器从尾静脉抽血1mL左右。一部分血液(约0.2mL)加入有抗凝剂的采血管中,用ABXPentra60血细胞分析仪测定血常规指标;其余血液(约0.8mL)注入玻璃采血管中,于4℃条件下静置,以3000r/min的转速离心10min,取血清在日立7020全自动生化分析仪中测定其生化指标;Na+、K+、Ca2+、Cl-等无机离子用S-2000电解质分析仪测定。1.5dunpan’s多重比较用SPSS16.0进行数据分析。实验数据经单因素方差分析后,进行Duncan’s多重比较,p<0.05为差异显著,p>0.05为差异不显著。2结果与分析2.1质量生产情况投喂实验结束后,D1到D5组实验鱼终体质量见表2。表2可见,D5组终体质量显著小于D1组和D2组(p<0.05),其他各组间差异不显著(p<0.05)。2.2嗜中性红细胞密度和巨大不成熟细胞比例表3表明,D3组血红蛋白浓度、血栓细胞密度和平均血栓细胞体积显著低于D1组(p<0.05),D4组嗜中性粒细胞密度和巨大不成熟细胞比例显著高于D1组(p<0.05),各组其他指标无显著差异(p>0.05)。2.3各组各各组未显著差异表4表明,D3组褐点石斑鱼血清中总蛋白(TP)含量显著低于D1、D4组(p<0.05),其他组之间无显著差异(p>0.05);各组白蛋白(ALB)含量无显著差异(p>0.05);D3组球蛋白(GLB)含量显著低于D1组(p<0.05),其他组之间无显著差异(p>0.05);D3组白、球蛋白比显著高于其他组(p<0.05),其他组之间无显著差异(p>0.05)。2.3氨酶、尿素氮以及尿酸含量由表5可见,各组褐点石斑鱼血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮以及尿酸含量均无显著差异(p>0.05);D5组的肌酐含量显著高于D1组(p<0.05),与D2、D3、D4组无显著差异(p>0.05)。2.4其他组之间比较由表6可见,D3组褐点石斑鱼血清中的血糖(Bloodsugar,BLS)含量显著低于D1组(p<0.05),其他组之间无显著差异(p>0.05);D2、D3、D5组的甘油三酯(Triglyceride,TG)含量显著低于D1、D4组(p<0.05);各组总胆固醇(Cholesterol,CHOL)含量均无显著差异(p>0.05)。2.5不同剂量石斑鱼饲料对蛋白代谢的影响由表7可以看出,各组褐点石斑鱼血清中K+、Na+、Cl-、Ca2+的浓度均无显著性差异(p>0.05),可见该石斑鱼饲料中蛋白质成分的变化对其血清无机离子的影响较小。3讨论3.13血糖、血脂和嗜中性细胞有研究表明,鱼类处于饥饿状态时其血红蛋白含量会显著上升。陈惠群等观察到,饥饿8d会导致鳗鲡(Anguillajaponica)血红蛋白含量显著上升,而红细胞数则显著下降。乔志刚等则发现,短期饥饿(7d)的鲇(Silurusasotus)红细胞数和血红蛋白含量呈上升趋势;而饥饿至21d,血红细胞数低于饥饿处理前,血红蛋白含量虽略高于饥饿处理前,但也呈下降趋势。在本实验中,豆粕替代20%鱼粉组的血红蛋白含量显著小于全鱼粉饲料组,而其他各组与全鱼粉饲料组无显著差异,说明摄食替代蛋白饲料的实验鱼并未处于饥饿状态。豆粕替代20%鱼粉组的血红蛋白含量较低可能是由于豆粕蛋白的氨基酸组成不平衡造成的,可见豆粕替代20%鱼粉的饲料无法满足褐点石斑鱼幼鱼快速生长的营养需求,长期投喂(56d)会对其血红蛋白合成产生不良影响。此外,本实验在豆粕、玉米蛋白粉、啤酒酵母替代一定比例的鱼粉后,各组红细胞密度、白细胞密度和平均红细胞体积无显著性差异,这可能是因为褐点石斑鱼属肉食性鱼类,对血液生理指标有较强的调节能力。鱼类血栓细胞具有与哺乳动物血小板相似的凝血功能。在本实验中,20%豆粕替代鱼粉组血栓细胞密度、平均血栓细胞体积相对于对照组显著降低,而其他组差异不显著,说明饲料中大豆蛋白含量增加会导致实验鱼血栓细胞体积减小和数量减少,可能是大豆蛋白中存在的红细胞凝集素影响了褐点石斑鱼血栓细胞的生成。嗜中性粒细胞是鱼类重要的非特异性免疫细胞。研究表明,摄食大豆蛋白饲料的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)白细胞数量、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞活力上升,表明实验鱼可能存在过敏或炎症反应。此外,巨大不成熟细胞增加也表明鱼类可能发生了血液病变。在本实验中,玉米蛋白替代10%鱼粉组的嗜中性粒细胞密度和巨大不成熟细胞比例显著高于其他组,说明实验鱼可能处于受胁迫或过敏状态。3.23大豆分离蛋白替代饲料对鱼粉比例的影响生物血清中的总蛋白(TP)含量变化能够反映生物肝脏合成功能异常和肾脏病变而造成蛋白质丢失的状况,被用作鱼体对环境应激因子反应的指示物。血液中的白蛋白(ALB)是一种营养物质载体,是机体蛋白质的来源之一,可以维持血浆渗透压,修补组织,并提供能量。血液中的球蛋白(GLB)由浆细胞分泌,是机体抵抗力高低的反映。徐奇友等研究发现,随大豆分离蛋白替代饲料鱼粉比例的增加,肉食性的哲罗鱼(Huchotaimen)血清中总蛋白含量逐渐减低,球蛋白的含量先下降后上升,但差异都不显著;大豆蛋白完全替代鱼粉时血浆白蛋白显著降低,可能是因为哲罗鱼对替代饲料的采食量下降,影响了体内氨基酸的合成。Rumsey等的研究发现,与摄食全鱼粉的虹鳟(O.mykiss)相比,摄食大豆蛋白饲料的虹鳟血清总蛋白和免疫球蛋白含量都有所上升。刘襄河等研究发现,随着饲料中豆粕替代鱼粉比例的增加,牙鲆(Paralichthysolivaceus)血清总蛋白含量逐渐降低,当动植物蛋白比为1∶1时差异显著。本实验表明,3种蛋白源替代鱼粉都导致褐点石斑鱼幼鱼血清中总蛋白和球蛋白含量降低,其中豆粕替代20%鱼粉组与对照组差异显著,说明用豆粕替代20%鱼粉饲料已对褐点石斑鱼幼鱼的免疫机能产生显著的不良影响。各饲料组实验鱼血清中白蛋白含量差异不显著,说明这几种替代饲料基本能够满足褐点石斑鱼幼鱼的蛋白质需求。在本实验中,投喂20%豆粕替代鱼粉饲料降低了褐点石斑鱼幼鱼的免疫球蛋白含量,导致白球蛋白比显著上升。3.33不同蛋白源对鱼粉血清蛋白的影响转氨酶是生物体内氨基酸代谢的催化剂,当肝脏组织病变而引起肝细胞膜通透性增加,细胞内的转氨酶大量释放出来进入血液,引起血液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)浓度的升高,因此血液中转氨酶的活力也可作为作肝功能的指示物。研究表明,草鱼(Ctenopharynodonidellus)饲料中添加300g/kg的菜籽粕不会影响血清中ALT和AST的活性,但是在饲料中直接添加菜籽作为脂肪源,会对草鱼的肝胰脏造成一定损害,使草鱼血清中转氨酶活力大幅提高,导致其非特异性免疫力下降。在本实验中,摄食3种蛋白源替代鱼粉饲料的褐点石斑鱼转氨酶的活力无显著差异,说明这3种蛋白源以较低比例替代鱼粉时对褐点石斑鱼的肝功能无明显不良影响,但是D4组转氨酶的活力在各实验组中最高,提示玉米蛋白替代鱼粉对褐点石斑鱼的肝胰脏具潜在威胁。血清中的尿素氮可以反映生物的蛋白质代谢状况,血清中尿酸和肌酐含量则反映了肾脏的功能,研究表明,在草鱼饲料中添加300g/kg的菜籽粕对血清中的肌酐含量无显著影响,大豆分离蛋白替代鱼粉(最高替代100%)也不会对哲罗鱼(H.taimen)血浆中肌酐含量产生显著影响,但是全光照和全避光条件下的中华鲟(Acipensersinensis)幼鱼血浆中肌酐含量均比对照组含量高,说明肾脏受到了不同程度的损伤。本实验中,各饲料组实验鱼血清中尿素和尿酸的含量均无显著差异,除摄食酵母蛋白替代饲料(D5组)实验鱼血清中的肌酐含量显著小于摄食全鱼粉饲料(D1组)的实验鱼之外,其他各饲料组实验鱼血清中的肌酐也无显著差异,说明酵母作为蛋白源可能会对褐点石斑鱼的肾脏功能产生不良影响。3.43玉米蛋白和糖质蛋白血糖含量是反映生物碳水化合物代谢水平的重要生化指标,当鱼类积极摄食,健康状况良好时,血糖浓度较高。王崇等观察到,饲料中豆粕含量越高,杂食性的异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)血清中的葡萄糖含量越高;而陆阳等的研究则表明,随着膨化豆粕替代鱼粉的比例从20%上升到80%,肉食性的虹鳟血糖浓度有逐渐下降的趋势,但差异不显著。本实验条件下,豆粕替代20%鱼粉饲料组血糖浓度显著低于对照组,说明在肉食性鱼类的饲料中添加过量豆粕等植物性蛋白可能会导致其碳水化合物吸收不良,致使血糖浓度降低。血液中的甘油三酯和总胆固醇含量是反映鱼类体内脂肪代谢水平的重要生理指标,其含量过高表明鱼类肝脏中堆积的脂肪较多,容易导致脂肪肝、肝肥大等症状;而其含量过低则表明鱼类营养不良,生长状况受到影响。研究发现,随着饲料中玉米蛋白替代鱼粉比例升高,肉食性的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)血清中胆固醇和甘油三酯的含量显著降低,生长状况受到影响;随豆粕替代鱼粉比例提高,肉食性的虹鳟(O.mykiss)血浆中的胆固醇也呈现降低趋势;而杂食性的异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)胆固醇含量显著降低,但甘油三酯的含量升高,生长速率显著降低;刘襄河等的研究则发现,随着豆粕替代鱼粉比例的增加,肉食性的牙鲆(Paralichthysolivaceus)血清中的胆固醇和甘油三酯的含量逐渐上升,生长状况受到影响。本实验发现,3种蛋白源以较低比例替代鱼粉时对褐点石斑鱼总胆固醇含量无显著影响,玉米蛋白替代鱼粉组对血液中甘油三酯的含量也无显著影响,但豆粕和啤酒酵母这两种蛋白替代鱼粉显著降低了血液中甘油三酯的含量,且豆粕替代比例越高,甘油三酯的含量下降越明显。上述研究结果表明,过量植物蛋白替代饲料中的鱼粉会导致鱼类血液中甘油三酯和总胆固醇含量产生显著变化,可能升高也可能降低,对鱼类的生长会产生不良影响;植物蛋白替代饲料中的鱼粉对鱼类血脂的影响可能与植物蛋白的种类以及鱼类生理特点都有关系,其内在机理有待深入研究。3.53无机离子浓度的变化Na+、K+、Ca2+、Cl-等无机离子在维持鱼类血浆渗透压和酸碱平衡,保持内环境稳定起着重要作用,在受到环境的胁迫作用之后血液无机离子浓度