3-np对运动大鼠纹状体的保护作用

3-np对运动大鼠纹状体的保护作用

事实上，条纹体包括身体的学习记忆、感觉感知、运动和协调机。此外，hd（hunterondisease）不独立舞蹈样的运动、神经精神障碍和认知功能的降低明显与线条体的机械作用有关。临床和实验表明，hd的病理变化明显伴有着条纹体。兴奋毒性损害机制牵涉人类HD的发生和发展过程,喹啉酸(quinolinicacid,QA)为其实验研究的典型动物模型;其为谷氨酸类似物和NMDA受体激动剂,通过促进皮质神经元谷氨酸的释放和干扰谷氨酸的重吸收选择性地作用纹状体神经元。而另一假说是HD时神经元线粒体代谢机能障碍牵涉到琥珀酸脱氢酶,此能量代谢损害激发NMDA受体过度激活,进而导致细胞内钙超载和神经元死亡。因此,琥珀酸脱氢酶抑制剂3-硝基丙酸(3-nitropropionicacid,3-NP)作为HD能量代谢障碍机制方面的实验研究模型。综观目前HD的实验研究,在形态学方面仍有许多尚待证实的问题,包括纹状体损害的定位、神经元损伤的类型和性质的确切鉴定。为此,本研究以3-NP作为实验动物模型探测证实3-NP诱导实验大鼠的运动行为学变化,组织学证实3NP导致纹状体损害的部位,以及纹状体不同类型神经元对3NP损害的敏感特异性,为全面认识HD的病理机制提供形态学资料。1材料和方法1.1动物分组、给药和输注正常雄性成年SD大鼠20只,体质量250～300g(中山大学实验动物中心提供)。3-NP(Sigma,12.5mg/mL,生理盐水配制)腹腔注射(20mg·kg-1·d-1),2次/d,连续给药5d。大鼠完成给药12h后处死。用于组化和免疫组化染色的动物,用25%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.7mL/kg体重),经过心脏快速灌注0.9%生理盐水400mL,继用4%多聚甲醛(0.1mol/LPB配制,pH7.4)400mL灌注固定。常规取脑后浸于20%蔗糖(含4%多聚甲醛)中,4℃,直至沉底。半导体冰冻系列切片(厚40μm),备用于各种组织学染色。1.2前嘴唇停留时间的测定于3-NP处理前5d至注射后5d(共计10d),实验大鼠分别进行握力测试和平衡木测试。握力测试:在厚的泡沫垫上空50cm处悬挂一根长35cm、粗2mm的钢丝,记录大鼠前爪在上面悬挂的时间。一天测试两次,共10d。平衡木测试:让大鼠从平衡木(长120cm,宽7cm,离地面35cm处)的一端走到另一端的食物箱内(24.5cm×20.0cm×18.0cm),每天测试3次,共10d。记录大鼠前进之前的停留时间(启动延搁时间,包括大鼠被放到平衡木起点到开始前进20cm的时间间隔),通过全程的时间(从大鼠被放到平衡木起点到鼻子刚好进入暗箱的时间间隔),以及前爪滑落的次数(即footslips,前爪低于平衡木表面以下1.5cm的次数)。如果大鼠落下或时间超过3min即为未完成。1.3免疫组化1.3.1sl组化染色取5只动物脑块按照常规步骤进行切片HE和Nissl组化染色。Tunel染色严格按照InSituCellDeathDetectionKit,POD(Roche)试剂说明书步骤进行。1.3.2切片处理与形片制备取5只动物,用0.9%生理盐水灌注,快速取脑,置于新鲜配制的Golgi-cox溶液中,室温,避光浸泡14d。转入30%蔗糖,室温,避光浸泡3～5d。振动切片,收集于70%酒精中,裱片,晾干。DW洗1min,28%氨水1∶1(in双蒸水)避光30min,双蒸水洗1min,避光放置30min,梯度酒精脱水,透明,封片。1.3.3恒冷切片、烘干取5只动物,用冷PBS(含10%甘油)灌注,快速取脑,恒冷切片。裱片,晾干。用0.3%mmol/LNBT,0.05molPB和0.05M/L琥珀酸钠混合液染色,37℃,30min。室温晾干,脱水,透明,封片。1.3.4小鼠和兔darpp32表达对药敏试验取5只动物脑切片。步骤如下:(1)0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次;(2)0.3%双氧水(0.1mol/LPB,pH7.4),室温,30min;(3)小鼠单克隆抗NeuN抗体(1∶500,Chemicon公司),兔多克隆抗Darpp32抗体(1∶250,CellSignaling公司),4℃,36h;(4)相应的抗小鼠或抗兔IgG(1∶100,Sigma公司),室温,3h;(5)相应的小鼠或兔PAP(1∶200,Sigma公司),室温,2h;(6)DAB-H2O2显色2～8min。各步骤之间用0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次,每次5min。在完成显色之后进行裱片,常规脱水、透明、封片。1.4统计处理对所获实验数据用SPSS软件进行均数比较的单向方差分析(one-wayANOVA),P<0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.13-np诱导前后大鼠前3-np前3-n前3-n前3-np前3-np前3-np前3评分的比较纹状体牵涉到机体运动和运动协调机能。因此,本实验设计对3-NP模型大鼠进行运动行为学检测和评价。平衡木测试结果显示,实验大鼠的启动延搁时间和完成全过程时间均比3-NP诱导之前明显延长(P<0.05,P<0.05,图1C),同时显示3-NP处理的大鼠前爪滑落次数与3-NP处理之前相比较也具有统计学差异(P<0.05,图1A′、1D)。握力实验测试结果显示,3-NP处理大鼠的抓握时间也比3-NP处理之前明显延长(P<0.05,图1B、E)。2.23golgis染色组织学(Nissl和HE染色)探察显示3-NP诱导纹状体的损伤区恒定出现于纹状体的背外侧区,其出现率为80%(12/15),在损伤区(见图2A,B,星号示)和周边区神经元发生严重丢失,在周边区可见一些体积较大染色较深的神经元幸存(图2A′和B′,黑色箭头示)和炎症细胞浸润(白色箭头示)。经典Golgi组化染色显示纹状体损伤区也在纹状体背外侧区明显可见(图2C,星号示),在周边区神经元的数量显著减少,受累神经元的树突出现明显的形态学变化(图2C′);可见树突呈现锐角弯曲(白色箭头示)和断裂(黑色箭头示)。琥珀酸脱氢酶SDH(succinatedehydrogenase)组化染色在纹状体背外侧区同样出现一块明显的淡染区(图2D,星号示),在其周围和远离区可见一些深染色的细胞(图2D′,箭头示)。2.3经元数量的变化业已证实,NeuN为神经元特异性抗体。借助此抗体染色显示3-NP导致纹状体背外侧呈现一块恒定的损伤区(图3A★),在其周围可见一个淡染色环,在纹状体损伤区域神经元绝大部分均已丢失,损伤周边区神经元的数量也显著减少(图3A′)。同时借助Darpp-32免疫组化染色(此被证实为纹状体投射神经元的特异性抗体)显示3-NP组的纹状体背外侧区(图3B,★)同样出现一块恒定的病灶区,该区域少见幸存的神经元,在损伤周边区神经元的丢失(图3B′)比NeuN阳性神经元更严重(图3A′),而且幸存的多为体积较大的神经元。Tunel组化为神经元凋亡的特异性染色,结果显示正常纹状体少见Tunel阳性细胞,但在3-NP组纹状体的损伤区(图3C,★)及其周边区均可见大量Tunel阳性细胞,高倍镜观察显示(图3C′)这些阳性细胞明显呈现大(见图3C′白色箭头所示)、小(黑色箭头所示)两种形态。3讨论3.1hd动物模型的筛选HD是一种常染色体显性遗传性神经退变性疾病,临床表现为不自主的舞蹈样运动、神经精神障碍和认知机能低下等特征,其病理学特征主要是纹状体严重萎缩和神经元大量丢失。尽管Htt(Huntingtin)基因现在已被鉴定并证实为HD的始动因素,兴奋毒性、代谢障碍和氧化应激仍然被认为是导致HD纹状体神经元死亡的重要原因。目前常用的HD动物模型有纹状体注射QA和腹腔注3-NP模型;前者所使用的QA为谷氨酸类似物和NMDA受体激动剂,通过促进皮质神经元谷氨酸的释放和干扰谷氨酸的重吸收选择性地作用于纹状体神经元。3-NP是琥珀酸脱氢酶的不可逆抑制剂,通过阻断三羧酸循环或线粒体电子传输链上的复合物-2产生毒性作用。3-NP模型与临床HD在病理变化和行为表现方面极为相似,由于3-NP能产生相对选择性的纹状体神经元死亡,从而完美地模拟人类HD的病理学和行为学特征。本实验为此采用3-NP大鼠模型,目前的平衡木和握力运动行为学测试结果再一次证实3-NP注射明显导致实验大鼠的肌肉强直和运动协调障碍。具有重要意义的是本实验从组织病理学方面的探测显示,3-NP诱导大鼠纹状体的损伤恒定出现于纹状体的背外侧区,而且主要病理变化为大量神经元的丢失,结合实验动物运动行为学严重障碍,这些结果明显提示3-NP对纹状体的损害具有选择特异性,更为重要的是可以借助此结果反证纹状体背外侧区域的运动调节机能。因此,本实验目前的资料对于后续深入研究纹状体生理机能和HD病理机制具有重要价值。3.2纹状体映射神经元形态学研究证实,纹状体是基底核的主要成分,与随意运动的稳定、肌张力的维持以及肢体姿势的调节活动相关。纹状体如此硕大的实质性团块,主要由大量的神经元所构成。因此,纹状体的细胞构筑极其复杂,其神经元在形态学方面主要分为投射神经元和中间神经元两大类型。前者包括纹状体-黑质(直接通路)和纹状体-苍白球(间接通路)神经元。后者包括胆碱能神经元,GABA/Parvalbumin神经元和Somatostasin/NOS神经元等。有研究显示,HD疾病主要损伤纹状体的投射神经元,而中间神经元则相对幸免。因此,本文目前的免疫组织化学实验中所借用的两种神经元特异性标记物,一种特异性地标记全部神经元(包括中间神经元和投射神经元);另一种仅仅特异性地标记纹状体投射神经元。虽然两种免疫组化结果均显示3-NP诱导纹状体神经元的严重丢失,但结果明显证实纹状体投射神经元的丢失更为严重。为进一步证实3-NP的作用机理和纹状体神经元的损伤性质,本实验结合SDH染色结果显示,在3-NP所诱导的纹状体损害区受累神经元SDH的活性明显降低,而在损伤周边及其远离区出现一些较大体积神经元的SDH强烈反应,这些神经元在