不同破壁方法提取黄酒麦曲中微生物总dna的比较研究

不同破壁方法提取黄酒麦曲中微生物总dna的比较研究

黄酒是中国的特产，享有“国酒”的美誉。黄酒的工艺、品种、口味历经千百年的历史沉积和文化锤炼才逐步形成了今天独具一格的魅力和神韵,是低粮耗、低酒精度、高营养的酿造酒,是提倡发展的酒种,符合酒类市场低度、营养、保健的消费趋势。以麦制曲、用曲酿酒是中国黄酒的特色,也是传统操作技艺,享有“酒之骨”之称。传统麦曲在黄酒中既是糖化发酵的粗酶制剂,又作为少量酿酒原料和营养物质保留在黄酒中。麦曲中蕴含着一个非常复杂的混合微生物体系,在制曲过程中大量生长,产生各种酶类,为黄酒的发酵提供必需的酶类。传统的方法研究麦曲中微生物具有很大的局限性:一是麦曲中的一些不可培养的微生物不能得到有效分离。二是只能静态地研究麦曲中的微生物,不能动态地研究制曲过程中微生物的生长变化过程。所以,传统方法无法弄清制曲过程中麦曲微生物生长变化情况。分子生物技术在混合微生物研究体系中的应用,极大地方便了动态研究微生物种群结构变化的情况,能够用来了解麦曲的微生物区系和种群数量,在认识微生物群落的动态变化上具有重要的作用。微生物分子生态学是通过分析样品中DNA分子的种类、数量等基因组信息来反映样品中微生物细胞的种类与种群比例等信息。它克服了培养方法的局限性,直接对环境样品中的微生物基因组DNA的组成状况进行分析评价,所以,样品总DNA的提取是研究的前提条件和关键,可靠、高效的混合样总DNA提取方法非常重要。通常,评价一种DNA提取方法的好坏主要从5个方面考虑:(1)所得DNA具备理想的纯度;(2)DNA要足够完整,破损程度小;(3)DNA的量要充足;(4)PCR扩增产物条带数尽可能多;(5)方法尽可能简便、省时、费用低。麦曲样品中成分复杂,提取麦曲样品总DNA用于分析其中微生物的多样性时,不仅要最大限度地提取到每个物种的DNA,而且要保证片断足够大,杂质少。如果用温和的提取方法进行提取,固然可以得到大片段的DNA,但又不能保证使样品中绝大多数的微生物破壁,会降低结果中的微生物多样性,而用剧烈的提取方法,能将绝大多数的微生物破壁,但往往使大量DNA被剪切,从而使得到的DNA没有分析价值。本文采用物理法(超声波)、酶法(Yatalase酶)、化学法(氯化苄)对黄酒麦曲样品进行破壁,提取微生物总DNA,并通过细胞裂解率、DNA的纯度、片段的分布情况、ITS(内转录间隔区)序列扩增产物的多态性来评估不同的破壁方法对麦曲样品总DNA提取效果的影响,确定一种合适的破壁方法来提取麦曲总DNA。1材料和方法1.1材料和样品的预处理1.1.1材料表面黄酒麦曲样品由黄酒公司提供。取样后立即保存于4℃,并于48h内抽提DNA;纯种微生物(米曲霉和酵母)为本实验室保藏菌种。1.1.2悬浮液悬浮液制备无菌条件下,将粉碎好的麦曲加入带玻璃珠的三角瓶中,加入无菌生理盐水洗涤麦曲,将悬浮液滤纸过滤后,滤液经离心收集沉淀,4℃保存备用。取适量无菌生理盐水洗涤纯种微生物的斜面,收集菌液,4℃保存备用。1.2不同的分解方法，不同的麦曲样品1.2.1超声波处理根据Picard等方法改进。取样品200mg,加入3mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振荡混匀,加入0.9mL10%SDS后,超声波(600W)在4℃冰浴下处理10min。离心,上清液0℃保存备用。1.2.2so4-3-1h42so4的制备取样品200mg,加入3mL苹果酸缓冲液(pH5.5)振荡混匀,加入2%Yatalase(TaKaRa,上海)和终浓度为0.6mol/L的(NH4)2SO4,30℃保温4h,每10min上下颠倒混匀。加入0.2倍体积的石英砂,剧烈振荡2min,离心,上清液0℃保存备用。1.2.3酶处理过滤法根据朱衡等方法改进。取样品200mg,加入2mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振荡混匀,加入0.6mL10%SDS、3mL氯化苄和0.2倍体积的石英砂,剧烈振荡混匀。50℃保温1h,每隔10min振荡混匀1次。加入1.5mL3mol/L醋酸钠(pH5.2),冰上放置15min,离心,上清液0℃保存备用。1.3-羟基苯磺酸te的制备取保存的上清液,加入0.1倍体积3mol/L的醋酸钠和0.6倍体积的异丙醇,冰上沉淀5min,10000r/min离心,沉淀用200μLTE溶解,加入适量RNAase,65℃水浴15min,加入200μL苯酚-氯仿(苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)抽提至界面无可见物,取200μL上清液加入氯仿:异戊醇(24:1)再抽提1次,上清液加入0.1倍体积3mol/L的醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇,10000r/min离心10min,沉淀用70%乙醇洗涤1次,室温放置,待乙醇完全挥发后,40μLTE溶解沉淀后,-20℃保存。1.4关于唾液和培养基的分解率计算采用血球计数板对裂解反应前后的孢子和酵母总数计数,计算裂解率。1.5总dna提取纯度和浓度测定应用GeneQuantPro(Biochrom,England),将提取的麦曲总DNA样品进行适当稀释后,分别测定DNA样品在260nm和280nm处的吸光值,并计算OD260/OD280的比值来确定样品的纯度、浓度和提取率。计算方法如下:式中*:OD值相当于50μg/mL的双螺旋DNA。1.6pcr扩增真菌真菌的ITS扩增参照White等的方法。引物pITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,pITS4:5’-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3’(上海生物工程公司合成)被用来扩增真菌的ITS(内转录间隔区)保守序列。PCR扩增的反应体系为:50μL的总反应体积中含有1μLdNTP(10mmol/L),5μL10×Buffer,10mmol的MgCl2,2.5U的TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物技术公司),引物pITS1、pITS4各10pmol,DNA模板量80ng。扩增条件:95℃变性5min,75℃加入TaqDNA聚合酶。94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,31个循环后,最后72℃延伸10min。ITS-PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色后,凝胶成像系统拍照,进行数据处理。2结果与分析2.1分离和提取dna一般提取环境样品中的DNA有2种方法:一是直接从环境样品中提取DNA。二是用等渗液、离心等方法使环境样品中微生物与各种杂质分离,然后提取微生物的DNA。麦曲中的霉菌和酵母菌附着在小麦麦粒上,若直接用麦曲来提取混合微生物的总DNA,物理法的破壁效率将十分低,酶法破壁用酶量也将很大。故实验采用无菌水冲洗麦曲至镜检基本无孢子和酵母后,过滤,离心浓缩,可得到麦曲中的霉菌孢子和酵母。2.2微生物的dna要对麦曲进行微生物多样性研究,微生物的完全裂解是确保提取麦曲中所有微生物DNA的产量、质量和多样性的前提。到目前为止,提取环境中总DNA的研究基本上集中在土壤、河流的沉淀物等的原核生物上。而对于真核生物的研究比较少,对于真菌孢子和酵母的裂解通常采用的方法有物理法(如超声破碎法、珠磨匀浆法)、酶法(如Yatalase酶、蜗牛酶破壁法)、化学法(如氯化苄法)。实验以米曲霉的孢子和酿酒酵母作参照,对麦曲微生物的浸提液采用了3种裂解方式,裂解率如表1所示。从表1中可以看出,采用超声波法裂解细胞的效率最低,化学裂解法的效率最高。2.3dna提取率计算采用3种方法提取的麦曲样品中微生物的基因组DNA,经纯化后测定DNA的OD260/OD280值,计算所得DNA浓度及提取率,结果见表2。一般DNA的OD260/OD280值接近1.8最好。从表2可以看出,氯化苄法的破壁效果最好,获得的DNA总量最多,但含有很多的杂质,纯度相对较低。其次是酶法,获得的DNA总量虽然不多,但是纯度最高。通过超声波法得到的DNA产量较低,而且杂质含量较高。2.4dna产物的序列采用不同方法提取DNA的片段的大小在琼脂糖凝胶上的分布如图1所示。从图1中可以看出,采用酶法和氯化苄法提取的DNA,产物片断分布均匀,从100bp~20kb均有。Picard等用超声波的方法处理链霉菌孢子3遍,裂解率达100%,而实验中超声波破碎方法的破壁率很低,只有25.9%左右,原因是超声波对真核生物的孢子和原核生物的孢子作用效果不同,得到的DNA片段长度也很小,集中分布在500bp~2000bp,不适合作为PCR扩增的模板。2.5多态性分析促进了iprc的产物3种方法提取的麦曲中微生物总dna的pcr扩增效果目前,还未能弄清楚麦曲中的微生物具体组成和制曲、发酵过程中微生物组成结构的变化情况等,传统的纯培养方式不能有效解决这些问题,分子生物技术在微生物生态上的应用,使得上述问题的解决成为可能。实验先是结合国外非常流行的珠磨均浆法,改进了氯化苄法提取麦曲中微生物总DNA,比较了超声波法、酶法、氯化苄法提取麦曲中微生物总DNA的效果,通过对破壁效率、纯度、得率和PCR扩增效果的综合分析,采用氯化苄法提取麦曲中微生物总DNA的破壁效率为(85.7±2.1)%、纯度为1.512、得率为75μg/g曲、PCR扩增的条带数为6条,因此选用氯化苄法提取麦曲样品中微生物总DNA。3种不同提取方法