食品中一般成分分析-蛋白质和氨基酸的测定

原理反应原理氨基酸具有酸性基团-COOH和碱性基团-NH2，根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH判断滴定终点,可测定氨基酸总量。反应原理电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法。普通滴定法是依靠指示剂颜色变化来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，终点的指示就比较困难，或者根本找不到合适的指示剂。反应原理电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算。反应原理因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定，氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。Part02仪器与试剂仪器与试剂1.仪器酸度计、磁力搅拌器、微量滴定管（10mL）磁力搅拌器酸度计微量滴定管仪器与试剂2.试剂20%中性甲醛溶液；0.05mol/L氢氧化钠标准溶液;Part03操作方法操作方法1.仪器校正开启酸度计电源，预热30分钟，连接复合电极。选择适当pH的缓冲溶液，测量缓冲溶液的温度，调节温度补偿旋钮至实际温度。将电极浸入缓冲溶液中，调节定位旋钮，使酸度计显示的pH值与缓冲溶液的pH值相符。操作方法2.样品的测定吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，打开磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计显示为pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL），可用来计算总酸含量。加入10.0mL中性甲醛溶液，混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）。操作方法同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧杯中，先用氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2,作为试剂空白试验。Part04结果计算结果计算式中：c---氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1---样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；V2---空白试验加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；m---测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014---1.00mL氢氧化钠溶液（c（NaOH）=1.000mol/L）相当于氮的质量，g/mmoL；

Part05注意事项注意事项1.氢氧化钠易与CO2反应且易受潮，因此氢氧化钠标准溶液在使用前需进行标定，确定其准确浓度。2.本法准确快速，可用于各类食品游离氨基酸含量测定；3.固体样品一般应先进行粉碎，准确称量后再加适量水在50℃水浴中萃取0.5h，再进行检测。注意事项4.浑浊和颜色较深的样品可不经处理直接测定。5.检测结果的准确度与酸度计的精确度密切相关，因此使用前酸度计需进行严格校正。标准pH缓冲液按照规定配置好以后为避免其pH值发生变化，存放时间不宜过长，否则直接影响到滴定终点，导致检测结果的不准确。6.久置的复合电极初次使用时，一定要先在饱和KCL中浸泡.

甲醛滴定法食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮即氨基酸态氮的百分率来表示。氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。

甲醛滴定法与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。氨基酸含量的测定可采用甲醛滴定法、电位滴定法、茚三酮比色法等。现以甲醛滴定法为例介绍氨基酸含量的测定。

Part01原理反应原理

氨基酸具有酸性的羧基（-COOH））和碱性的氨基（-NH2），它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。用强碱标准溶液滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应原理氨基酸不是单纯的一种物质，对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示。Part02方法特点及应用范围方法特点及应用范围

该法简单易行，快速方便，在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸态氮含量变化，以此作为控制发酵生产的指标之一。可用于测定各类食品中游离氨基酸总量。方法特点及应用范围脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。Part03反应试剂反应试剂

40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液将40%甲醛中和至淡蓝色。1g/L百里酚酞乙醇溶液；1g/L中性红50%乙醇溶液；0.1mol/L氢氧化钠标准溶液；Part04操作方法操作方法

吸取含有氨基酸20-30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终点；

操作方法另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。Part05结果计算操作方法式中：c---氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1---用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；V2---用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；m---测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014---1.00mL氢氧化钠溶液（c（NaOH）=1.000mol/L）相当于氮的质量，g/mmoL；

Part06注意事项注意事项1.氢氧化钠易与CO2反应且易受潮，因此氢氧化钠标准溶液在使用前需进行标定，确定其准确浓度。2.固体试样应先进行粉碎，准确称取后用水萃取。之后测定萃取液；

注意事项3.液体试样如饮料、酱油等可直接吸取进行测定。萃取可在50℃水浴中进行半小时即可。4.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。5.采用双指示剂法结果比单指示剂法结果更准确。原理原理氨基酸在碱性溶液中可与茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物，该产物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，最大吸收波长为570nm，可采用分光光度法测定样品中氨基酸含量。凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（除脯氨酸外）均有此反应。Part02仪器及试剂仪器及试剂1.仪器分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等；2.试剂（1）20g/L茚三酮溶液

称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色瓶中冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。仪器及试剂（2）pH8.04磷酸盐缓冲溶液准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用；准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用；取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为pH8.04磷酸盐缓冲溶液。仪器及试剂（3）氨基酸标准溶液准确称取标准氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解，再定量转入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀。准确吸取10.0mL于100mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，即为200ug/mL氨基酸标准溶液。Part03操作方法操作方法1.标准曲线的制作准确吸取200ug/mL的氨基酸标准溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL（相当于氨基酸含量0μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg），分别置于25mL具塞刻度试管中，各加水补充至体积为4.0mL。操作方法加入茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液各1mL，混匀，沸水浴加热15min，迅速冷却至室温，加水至刻度线，摇匀。静置15min后，在570nm下，以试剂空白作为参比液测定各标准溶液的吸光度。以标准溶液中氨基酸的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。操作方法2.样品测定吸取澄清的样品溶液1mL，加水至4mL，之后加入茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液各1mL，混匀，沸水浴加热15min，迅速冷却至室温，加水至刻度线，摇匀。静置15min后，在570nm下，以试剂空白作为参比液测定各标准溶液的吸光度。带入标准曲线得出样品溶液中氨基酸含量。Part04注意事项注意事项1.该法属于微量法，检测氨基酸含量灵敏度高，重现性好。2.脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm。注意事项3.样品处理方法一般为：准确称取粉碎样品5-10g或吸取样液5-10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤。用30-40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。4.茚三酮受阳光、空气、温湿度等影响被氧化变为淡红色或深红色时，使用前须进行纯化。定义氨基酸定义氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的中间产物为䏡、胨、肽等，最终产物为氨基酸。.Part02氨基酸种类氨基酸种类氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然产物中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种。.氨基酸种类营养学分类营养学分类侧链基团极性分类化学结构分类营养学分类（1）必需氨基酸构成蛋白质的氨基酸中，主要有8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食物供给，因此被称为必需氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。必需氨基酸对人体有非常重要的作用，常会因为在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强新陈代谢作用。

..营养学分类（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。（3）非必需氨基酸指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。

..化学结构分类脂肪族氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、

亮氨酸等芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸杂环族氨基酸：组氨酸、色氨酸杂环亚氨基酸：脯氨酸；.根据侧链基团极性分类非极性氨基酸（疏水氨基酸）：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸等；极性氨基酸（亲水氨基酸）：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸；.Part03氨基酸生理作用氨基酸生理作用氨基酸在人体内通过代谢可以发挥下列作用：1.合成组织蛋白质；2.变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质；3.转变为碳水化合物和脂肪；4.氧化成二氧化碳和水及尿素，产生能量。.Part04

测定意义氨基酸测定意义氨基酸在食品中的作用不可忽视，有的是调味剂，有的是营养强化剂，有的可起增香作用等。大多数氨基酸都有味感，在食品中起着酸、甜、苦、涩等味的作用。谷氨酸具有酸味和鲜味两种味，其中以酸味为主。当加碱适当中和后生成谷氨酸钠盐；生成盐以后．谷氨酸的酸味消失，鲜味增强。谷氨酸钠是目前广泛使用的鲜味剂---味精的主要成分。.氨基酸测定意义氨基酸与糖类物质发生羰氨反应是食品加工中重要的香气和上色的重要原因，在反应过程中消耗了一部分氨基酸和糖，生成了风味物质。氨基酸也会加热分解生成某些风味物质，或在细菌的分解下产生具有异味的物质，所以氨基酸是风味物质的前体物质。因此，氨基酸含量一直是很多调味品和保健食品的质量指标。.Part05氨基酸测定方法氨基酸测定方法鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的分析检测中可采用甲醛滴定法、电位滴定法、茚三酮比色法等测定氨基酸总量，也可采用薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法等对氨基酸含量进行测定，还可以对个别氨基酸进行含量分析。氨基酸测定方法近年来发展起来的全自动氨基酸分析仪，可以快速的测定食品中氨基酸组成及含量，可快速实现对氨基酸的定性和定量。.仪器及试剂仪器及试剂一、仪器常量凯氏烧瓶、常量凯氏定氮蒸馏装置；二、试剂浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、400g/L氢氧化钠溶液、40g/L硼酸吸收液；甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、0.1000mol/L盐酸标准溶液。Part02操作方法操作方法准确称取0.2-2.0g固体样品（半固体样品2-5g，液体样品10-20mL），小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20mL浓硫酸，稍摇匀后，安装消化装置，于凯氏烧瓶瓶口放一小漏斗，将瓶以45℃角斜支于有小孔的石棉网上。操作方法用电炉小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加大火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热微沸0.5h。取下冷却，小心加200mL蒸馏水，放冷后，加入玻璃珠数粒以防止蒸馏时暴沸。操作方法连接好常量凯氏定氮蒸馏装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入50mL，40g/L硼酸溶液及混合指示剂2-3滴）。放松夹子，通过漏斗加入70-80mL，400g/L氢氧化钠溶液，并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加入100mL蒸馏水（从漏斗中加入），夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏出液约250mL即可）。操作方法将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。操作方法将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量，同时做一试剂空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积，计算总氮量，再乘以样品换算系数，计算样品中蛋白质含量。Part03方法说明方法说明1.所有试剂应用无氨蒸馏水配制。2.消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏烧瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。方法说明3.消化过程中要注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。

方法说明4.样品中若含脂肪或糖类较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。方法说明5.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化。6.若取样量较大，如干试样超过5g，可按每g试样5mL的比例增加硫酸用量。方法说明7.一般消化至透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间。8.蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需要再增加氢氧化钠用量。方法说明9.硼酸吸收液温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。10.蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。11.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。原理原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2，6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。Part02仪器与试剂仪器与试剂1.仪器分光光度计、电热恒温水浴锅、10mL具塞玻璃比色管；分析天平。仪器与试剂2.试剂（1）氢氧化钠溶液（300g/L）：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL；（2）对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至100mL；

仪器与试剂2.试剂（3）乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL乙酸，加水稀释至100mL；（4）乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠，加水溶解稀释至500mL；仪器与试剂（5）乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液与40mL乙酸溶液混合，该溶液pH4.8；（6）显色剂：15mL甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3d）。（7）氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液于100mL容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。Part03操作步骤操作步骤1.样品消解称取充分混匀的固体试样0.1g-0.5g（半固体试样0.2g-1g、液体试样1g-5g）、移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45℃角斜支于有小孔的石棉网上。操作步骤缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。

操作步骤取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。操作步骤2.样液的制备吸取2.00mL-5.00mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1-2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至无色，用水稀释至刻度，混匀。操作步骤3.标准曲线的制作吸取0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1mL氨氮标准使用溶液（相当于0ug、5ug、10ug、20ug、40ug、60ug、80ug、100ug），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。操作步骤置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm下测定其吸光值，以各标准样品溶液中氮含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。操作步骤4.样品测定吸取0.5mL-2mL（氮含量小于100μg）样品溶液和等量试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。

操作步骤4.样品测定置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm下测定其吸光值，带入标准曲线计算出样品测定液中氮含量。操作步骤5.计算式中：X---样品中蛋白质的含量，g/100g；m---样品测定液中氮的含量，μg；m0---试剂空白测定液中氮的含量，μg；V1---样品消化液定容体积，mL；V3---样品溶液总体积，mL；m---样品质量，g；V2---制备样品溶液的消化液体积，mL；V4---测定用样品溶液体积，mL；F---蛋白质换算系数；操作步骤说明：此法不仅能满足对工艺过程的快速控制分析，而且具有环境污染少，操作简便，省时等特点。

概述概述1.蛋白质生理功能蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要组分，是生物体发育及修补组织的原料。人体内酸碱平衡、水平衡的维持，遗传信息的传递，物质的代谢及转运都与蛋白质有关。概述人及动物需要从食物中得到蛋白质及其分解产物，来补充自身的蛋白质，因此蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。概述2.蛋白质的含量及特性蛋白质在食品中含量变化范围很宽，不同食品中蛋白质含量差异很大，蛋白质广泛存在于动植物食品中。一般来说，动物性食品蛋白质含量高于植物性食品。概述2.蛋白质