奶牛性控冻精技术的发展与应用

奶牛性控冻精技术的发展与应用

牛的性别由性染色体决定。在生产中人们希望母牛多产母犊以加快奶牛群的扩繁速度和提高牛群的产奶量,因此对奶牛性别控制的研究就成为了奶牛繁殖科研工作者所关心的课题。奶牛性控冻精人工授精技术是将奶牛种公牛的精子通过精子分离仪使含X、含Y染色体精子得到有效的分离,将分离后得到的X精子进行分装冷冻制成冻精细管,进行奶牛的人工授精,从而使母牛怀孕产母犊的技术。根据有关专家的研究结果进行综合分析,采用性控冻精进行人工授精,奶牛情期受胎率为54.36%,比常规冻精受胎率(67.27%)低;使用性控冻精的青年牛受胎率(62.27%)比经产牛(39.40%)明显要高,母犊率为93.23%;使用性控冻精超排胚胎与常规冻精相比获得胚胎的数量和质量相近,鉴定胚胎雌性比例试验数据不低于92.98%,移植后可得到较高的怀孕率。奶牛性控冻精人工授精技术的应用对于增加奶牛数量和提高奶牛种群质量等具有重要意义,有着良好的应用前景。1精子分离技术从1902年McClung提出性别决定理论之后,对于性别决定有了划时代的突破。1910年,Guyer首次发现了性染色体。20世纪60年代流式细胞仪诞生,人们利用精子染色体DNA作为一种标记来分离哺乳动物X、Y精子的研究也从此逐渐展开。1989年,Johnson等用流式细胞仪成功地分离兔子活的X和Y精子,并通过人工授精得到兔子后代,雄性准确率为81%、雌性为94%。1993年,英国剑桥动物生物有限公司开展分离牛精子体外受精研究获得成功,性别准确率均达到100%。在1997~1999年间,美国人Seidel等做了分离公牛精子人工授精试验,所获得的怀孕率、产犊情况、初生重以及随后的生长发育与对照组的结果没有显著差别,产下犊牛的性别准确率X精子为83%,Y精子为90%。精子分离技术已申请专利保护,美国X、Y公司在1997年独家买断动物精子分离技术专利。英国Cogent公司是世界上第一家将分离技术投入生产的公司,到2000年7月为止,该公司在其属下的162个农场对2000头牛进行了人工授精,分离精子的平均怀孕率为52%,而非分离精子对照组为56%。中国分离精子研究起步较晚,但发展非常迅速。广西大学在2002年购入一台流式细胞仪,率先在国内开展了分离精子性别控制的研究。中国种畜进出口公司于2004年买入动物精子分离专利技术。到2006年,国内已有3家性控冻精生产厂家,这些单位应用美国X、Y公司的流式细胞仪(X、Y精子分离仪)生产的奶牛性控冻精,在中国进行了大量的性控冻精人工授精、生产体内和体外性控胚胎、性控胚胎移植等试验,取得了宝贵的经验和科学的试验数据,为我国家畜的性控繁育奠定了基础。2精子分离方法X、Y精子之间存在某些差异,如X、Y精子头部大小、重量和比重、外膜电荷、运动速度的差异等,人们可利用这些差异分离X、Y精子。目前,精子分离方法主要是“物理分离法”,包括流式细胞光度计法、免疫法、沉淀法、电泳法、离心法。现在生产中主要使用流式细胞仪分离X、Y精子。流式细胞光度计法是当前分离X、Y精子较准确的方法,其理论基础是:X精子的DNA含量比Y精子的高。对于牛,X精子比Y精子DNA含量高3.80%。DNA特异性染料着色量与精子DNA含量成正比,因此,X精子吸收的染料就多,X精子发出的荧光较强。具体的做法是:先用DNA特异性染料对精子进行活体染色,然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束,探测器根据精子的发光强度把电子信号传递给计算机,计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电,弱的带负电。即X精子带上正电荷,Y精子带上负电荷。当X精子和Y精子经过高压电场时会向不同方向偏转,达到分离的目的,用分离后的精子进行人工授精或对受精卵和后代的性别进行控制。此法具有重复性、科学性和有效性的特点,分离准确率高达90%。3关于牛性控制冷精人工的应用效果的研究3.1青年酵母的受胎情况王建国等试验表明:应用奶牛性控冻精人工授精母牛的情期受胎率为59.4%(342/576),其中青年牛为65.6%(240/366)、经产牛为48.6%(102/210)),同期普通冻精为60.6%(129/213);性控冻精人工授精的母牛后代母犊率为93.3%(319/342),普通冻精为48.8%(63/129)。吕自力等在2005~2007年对国内不同地区试验点进行统计,青年母牛和成年母牛情期的受胎率平均为63%(1087/1725),而统计青年母牛(15~17月龄)达到77.5%(213/275);性控冻精人工授精的母牛出生母犊率为93%(960/1032)。李怡等试验表明,性控冻精青年牛受胎率为64.9%(734/1131),常规冻精为68.9%(645/936),利用B超仪对性控冻精授精的68头妊娠55~90天的母牛胎儿进行了性别鉴定,母犊率为94.1%(64/68)。笔者对相关文献的试验数据统计分析,性控冻精人工授精平均受胎率为54.36%(3358/6177),比常规冻精的67.27%(814/1214)略低,使用性控冻精青年母牛的受胎率为62.27%(1652/2653),明显高于经产母牛的39.40%(764/1939),使用性控冻精获得的母犊率为93.23%(2368/2540)[8~9]。与李兰东等报道的2005年以来全国应用性控冻精授精的情期受胎率在50%以上(58%~77%)结果相一致,也与王振斌等报道的2000年美国XY公司应用奶牛性控冻精给10787头奶牛进行人工授精情期受胎率达到53%、青年母牛达60%以上,母犊率达到了93%的结果相一致,说明目前我国的性控冻精人工授精技术水平已基本成熟,达到了国际先进水平,在生产中推广应用没有太大的技术难题。3.2不同的存活时间王建国等对奶牛性控冻精与普通冻精解冻后在37℃水浴锅中存活时间进行检测试验,结果奶牛X性控冻精存活时间为5~12小时,比同种普通精子的存活时间短2~10小时。梁小军等试验表明:性控冻精解冻后活力为0.50,在38℃厌氧环境下,存活时间为6小时,比普通冻精低7小时。由此可以看出,性控冻精解冻后精子的存活时间比常规冻精短2~10小时,这就要求在进行人工授精时把握好输精的准确时间。3.3复输药物期间情期受胎率及输精时间王建国等试验表明:在母牛发情结束后6~8小时左右进行人工授精,其情期受胎率为67.1%,显著高于在母牛发情开始后8~12小时进行人工授精(56.1%)的情期受胎率(P<0.01)。在确定母牛卵泡发育的前提下,将精液全部输至发育侧子宫角大弯处,其情期受胎率为62.7%,高于母牛每侧子宫角输1/2支X性控冻精(46.1%)的情期受胎率,但二者之间差异不显著(P<0.05)。梁小军等试验表明:选择适宜的输精时间(发情结束后的2~4小时,或比常规输精时间晚4~6小时),实施子宫角深部输精,累计配种良种青年母牛348头,60天妊检受孕261头,受胎率为75.0%。从以上结果可以看出,只要技术人员正确掌握好奶牛性控冻精人工授精技术,把握好输精部位和输精时间,其受胎率与使用常规冻精差别不大。3.4人工感染性控冻精的实现方式李怡等试验表明:使用常规冻精对49头牛进行超排,头均可用胚胎为5.5枚,可用胚胎率为56.0%;使用性控冻精对50头牛进行超排,头均可用胚胎为4.6枚,可用胚胎率为49.0%,两者的差异不显著(P>0.05)。吕自力等在2005~2007年对不同地区的168头供体母牛采用性控冻精输精后共获得793枚可用胚胎,头均可用胚胎4.72枚,性控胚胎用PCR技术进行鉴定后的性控比率是雌性比92.98%(53/57)。黄河等应用性控冻精对75头超排供体母牛进行输精,共采集胚胎633枚,其中可用胚胎339枚,退化胚胎135枚,未受精卵159枚。胚胎的受精率为74.9%(474/633),可用率为53.6%,发育率为71.5%,头均获得可用胚胎4.5枚。应用LAMP法对61枚胚胎进行性别鉴定后,确定雌性胚胎比例为1∶1(61/61)。11枚性控冻精生产的体内性控冷冻胚胎移植后,怀孕率为63.6%。因此,应用性控冻精对供体母牛进行输精,不仅可获得与常规冻精输精后相接近的胚胎数量和质量,鉴定胚胎雌性比例高(上述数据不低于92.98%),而且移植后可得到较高的怀孕率。应用性控冻精生产体内性控胚胎,可在我国胚胎移植技术中大量推广应用。4在中国的非点源控制和冷冻技术的推广方案和解决措施中4.1加大宣传,强化农民对性控冻精的学习X、Y精子分离技术是近年来走向生产的,分离出的X精子比例达90%以上,存在性控冻精细管每剂量含有效精子数少(目前生产的0.25毫升细管型性控冻精200万~240万个/支,常规冻精≥1000万个/支)、解冻后精液活力低等情况,有的人就担心使用性控冻精进行人工授精受胎率低、产生弱胎和畸形胎、遗传品质不佳等,这需要加大性控繁育的宣传力度,加强养殖户对性控冻精知识的学习了解,对奶牛配种技术人员加大人工授精技术操作培训工作。从目前应用性控冻精的效果来看,只要技术人员真正掌握性控冻精人工授精技术,使用性控冻精的奶牛受胎率与使用常规冻精差别不大。4.2严格控冻和输精在使用性控冻精进行奶牛人工授精中,有些地方反映受胎率低及出现爆管现象,这主要是因为选择受配母牛不当、奶牛健康或体况不佳、配种时间掌握不准确、解冻技术操作不当、发情鉴定不准确、授精技术不当等原因造成。应首选营养状况良好、生殖系统发育正常、无繁殖障碍性疾病、父母代均为高产奶牛的青年母牛作为受配母牛。严格人工授精技术操作规范,认真做好奶牛发情鉴定,正确进行性控冻精细管的解冻,严格进行输精前的清洗消毒,熟练掌握输精技术,把握好输精部位,做到适时输精。认真对待性控冻精人工授精工作的每一个细节,减少技术失误,从而提高其受胎率。4.3使用优质性控冻精目前优质奶牛性控冻精细管在100~300元/支,常规冻精仅为每支几十元,性控冻精价格较高,牛场使用谨慎,推广应用缓慢。然而,使用优质性控冻精细管的后代母犊率在90%以上,并且后代生产性能良好。从牛场的长期利益考虑,使用性控冻精可减少公犊出生比例,提高牛群质量,加快繁育速度,远远比使用常规冻精划算。只要配种技术人员技术过硬,使用性控冻精的受胎效果比常规冻精相差不大。奶牛场应积极推广性控冻精人工授精技术,可采用在标准化规模奶牛场试点,以点带面、示范带动等方式,扩大性控冻精人工授精的覆盖面,增加社会的整体效益。5牛奶冷冻技术的应用前景5.1优质高产牛奶可增强量降目前我国奶业和奶牛业正处于发展阶段,奶制品和优质高产奶牛都存在严重的缺口。2007年底,奶牛存栏1200万头,成年奶牛平均单产3.8吨,人均占有鲜奶20千克,仅为世界人均占有量(95千克)的1/5,与世界发达国家人均占有鲜奶140千克相比差距甚远。随着我国国民收入的增加,对牛奶的需求也逐年增加,从而促进了奶牛业的发展。采用优质高产的奶牛性控冻精进行人工授精,奶牛产母犊率可达到90%以上,极大缩短了奶牛世代间隔时间,使奶牛扩繁速度加快;同时优质高产奶牛性控冻精的使用,使奶牛的整体生产性能提高。这对我国高产优质奶牛的扩繁具有极大的推动作用,在我国具有良好的应用前景。5.2经济效益分析优质高产奶牛性控冻精人工授精技术的应用降低了公犊的自然出生比例,减少了牛场饲养奶牛公牛犊的经济支出和人员的浪费。同时优质高产的奶牛价格远远高于一般的低产奶牛,高产奶牛的产奶量可以达到年产8~9吨,也远远高于低产奶牛(年产3~4吨),二者经济效益相比相差甚远。因此奶牛性控冻精人工授精技术的应用可以增加奶牛养殖的经济效益。5.3将性控冻精人工授成经济增长效应同期发情、超数排卵、胚胎移植、生物基因工程技术、细胞克隆技术等一系列技术的研究日益成熟,在奶牛生产繁殖中逐步得到应用,若在生产中与性控冻精