一测多评法同步测定连翘中4种主要成分的含量

一测多评法同步测定连翘中4种主要成分的含量

关于一测多评价方法的研究理念已成功应用于同一类型的组分的质量评价。所包含的化合物包括肥皂、黄酮和碱性。所使用的药物包括白木通、人参、三七、黄药等。其中,黄连的一测多评评价标准已被2010年版《中国药典》采纳。本实验将以连翘为研究对象,深入探讨不同类型化合物之间开展一测多评研究的准确性与可行性。连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]为木犀科连翘属落叶灌木,其果实入药,具有清热解毒、消肿散结功效,是一味常用中药。一直以来,包括2005年版《中国药典》在内,都是以连翘苷作为连翘药材的质量控制指标,但近年来以抗菌、抗病毒活性成分连翘酯苷作为质量控制指标的研究越来越多,并且2010年版《中国药典》已确定将连翘酯苷作为质量控制指标,鉴于多种原因,本版药典没能同步测定这两种成分,另外,研究还发现芦丁、连翘酯素亦是连翘中的主要成分,与连翘的临床功效具有密切相关性。因此建立以连翘酯苷等多个有效成分为指标的标准,能更好地控制其质量。然而主要有效成分连翘酯苷的稳定性差、纯化难度亦大,必将给未来的质量控制带来不便。为此本实验以结构稳定、价格低廉的芦丁作为内参物,采用一测多评来同步测定连翘中多个有效成分的含量,这样不仅能大幅度降低检测成本和时间,还能提高方法的实用性和更有效地控制药材的质量。1gc/ms测定谱柱、kramasil100-lWaters2695-2996高效液相色谱系统,Empower工作站(Waters公司);Agilent1100高效液相色谱系统,AgilentChemStation工作站;色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm);KQ-100超声仪(40kW);乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯;芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘酯素均为实验室自制,其中芦丁、连翘苷、连翘酯素纯度均达98%以上,连翘酯苷A因其不稳定,纯度为97%以上;连翘药材采购自河南、陕西、山西、江西、江苏等地,经本所生药室何希荣主管技师鉴定为木犀科植物连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]的干燥果实。2分析和结果2.11个研究和多评价理论的研究2.1.1流动相色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)。流动相为乙腈-水(含0.3%冰醋酸),梯度洗脱程序见表1,流速0.8mL·min-1,柱温30℃,检测波长275nm。上述色谱条件下,各组分分离度良好,见图1。2.1.2检测波长的确定芦丁为黄酮醇类,连翘酯苷A为苯乙醇苷类,连翘苷、连翘酯素为双环氧木脂素类,4种目标成分的全波长紫外吸收见图2,兼顾上述4个成分,选择275nm作为检测波长。2.1.3混标溶液的配制取芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘酯素4种对照品,精密称定,依次为4.08,13.89,4.15,4.47mg,分别置于10mL量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度。精密移取上述4个对照品溶液各1mL,置于10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得混标溶液。于4℃保存备用。2.1.4滤过、吸光度的测定取连翘药材粉末(过40目筛)约0.3g,精密称定,置于50mL锥形瓶,精密加入体积分数70%甲醇水溶液10mL,称定,超声30min,补足质量,摇匀,用滤膜(0.22μm)滤过,即得。2.1.5进样分析精密吸取上述混合对照品溶液2,4,6,8,10μL,进样分析,每个浓度进样2次,取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归,芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素的标准曲线见表2。2.1.6采用回归因子计算以芦丁为内参物,按公式,计算连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素对芦丁的相对校正因子,分别为0.559、0.696、0.837。2.1.7加样回复突变试验精密吸取同一供试品溶液10μL于同一天内连续进样5次,记录芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素的峰面积,得出日内精密度的RSD分别为1.2%,0.7%,2.3%,3.5%;吸取同一供试品溶液10μL连续进样3d,每天3次,记录以上4个成分的峰面积,得出日间精密度的RSD分别为2.9%,1.4%,2.7%,3.5%。表明仪器较为稳定。2.1.8峰面积积分值精密吸取同一供试品溶液10μL,分别于配制后的0、2、4、8、12、24、48和72h测定峰面积积分值,芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素在3d内峰面积的RSD分别为3.1%,1.4%,2.7%,3.5%。表明处理后的样品在3d内稳定。2.1.9平均含量测定称取同一批连翘(产地新乡)样品的药材粉末(40目),约0.3g共6份,精密称定,按供试品溶液处理方法制备,测定芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素的平均含量分别为0.084%,0.41%,0.073%,0.052%,RSD分别为3.8%,4.7%,6.6%,5.2%。2.1.1加样回收试验取0.15g已知含量的连翘药材粉末(40目)5份,精密称定,分别按各成分在药材中的含量精密加入对照品溶液,相当于芦丁0.235mg,连翘酯苷A0.599mg,连翘苷0.103mg,连翘酯素0.073mg,按“2.1.4”方法制备样品,测定,计算加样回收率,芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素的加样回收率分别为104.7%,99.8%,105.1%,100.6%,RSD分别为3.2%,2.6%,4.0%,2.7%。2.2重建因子的再现研究2.2.1聚酯的相对校正因子实验考察了Waters2695-2996、Agilent1100两种高效液相色谱系统,每种型号的仪器各两台,考察了AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)两种色谱柱。计算连翘酯苷、连翘苷、连翘酯素对芦丁的相对校正因子依次在0.541～0.624,0.637～0.769,0.76～0.922;其中,不同仪器所得相对校正因子的RSD在5.2%～7.5%,同一仪器不同色谱柱所得相对校正因子的RSD在0.29%～6.9%。2.2.2不同品牌回收率和色谱柱的重现性知道芦丁的保留时间,利用目标成分对于芦丁的相对保留时间,即可对峰进行定位,考察此参数在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性,其中连翘酯苷A对芦丁的相对保留时间在1.102～1.124,连翘苷的相对保留时间在2.195～2.306,连翘脂素的相对保留时间在3.334～3.701,RSD分别为0.66%、2.1%、4.6%。2.3芦丁、麻黄酯苷a、麻黄酯素a、麻黄酯素a含量的比较分别精密吸取不同批次药材供试品溶液各5μL注入高效液相色谱仪,测定。采用外标法和一测多评法计算连翘药材中芦丁、连翘酯苷A、连翘苷和连翘酯素的含量,结果见表3。比较两种方法所得到的含量值,其中连翘酯苷A的相对误差在3.42%～4.29%,连翘苷的相对误差在1.10%～1.90%,连翘脂素的相对误差在0.75%～3.21%;表明两种含量测定方法得到的含量值之间无显著性差异,一测多评法应用于连翘中不同类成分的质量评价是可行的。3流动相系统实验结果分析3.1由于连翘酯苷不稳定,高温易分解,实验选择超声提取方法制备连翘药材供试品溶液。在查阅文献、借鉴前人研究基础上,本实验选用不同浓度甲醇、乙醇、水作为提取溶剂进行提取,结果以体积分数70%甲醇作为溶剂,超声提取,目标成分提取率较高,分离度较好,干扰的杂质峰较少,且方法简单,成本较低,故本实验选用体积分数70%甲醇超声方法制备供试品溶液。3.2实验比较了甲醇-水、乙腈-水,加入冰醋酸、磷酸盐、四氢呋喃等流动相系统,及其不同比例洗脱系统,结果发现,乙腈-水-冰醋酸的分离效果优,目标峰达基线分离,且重复性好。流动相中加入冰醋酸,可以改善分离效果,防止拖尾,使峰形尖锐、对称。简化流动相系统可提高实验的重复性。3.3本实验建立了连翘中不同类成分的一测多评法,同时检测芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘酯素。连翘酯苷A、连翘苷为连翘中的特征性成分;考虑到连翘酯苷A稳定性不好,纯化难度大,对照品不易得到;而芦丁对照品廉价易得且在连翘中含量较高,因此选择芦丁为内参物,更能体现一测多评方法的简便、易操作、低成本。3.4本实验以芦丁为参照,根据目标峰与内参物峰之间的相对保留时间,结合各峰的紫外吸收特征、峰形等信息,即能够正确判断出各目标峰的准确位置,由此表明,利用上述方法进行峰的定位是可行的。3.5芦丁为黄酮醇类,连翘酯苷为苯乙醇苷类,连翘苷、连翘酯素为双环氧木脂素类,为兼顾4个成分的吸收强度和吸收峰的平稳程度,选择275nm作为检测波长。3.6建立连翘中不同类成分的相对校正因子评价过程中,我们考察了不同色谱柱、不同液相色谱仪器影响,结果表明,与同类成分间相对校正因子的RSD值比较,不同类成分间相对校正因子的RSD偏大