发酵法提取核糖核酸rna

发酵法提取核糖核酸rna

核糖核酸（rn）是生命存在的重要基础。RNA及其核酸酶分解产物肌苷酸、鸟苷酸、鸟嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸等,在医药、食品、化妆品以及农业等行业中具有重要的用途。此外,近年的一些研究表明RNA具有维持机体免疫功能、抗氧化、提高机体蛋白质和铁的生物利用率、降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。因此,RNA的开发研究越来越受到重视。从微生物中提取RNA是工业上最实际和最有效的方法。酵母中RNA不仅含量高,而且适合于工业化生产。随着我国啤酒行业的日益发展,啤酒厂淘汰的废弃酵母泥不断增多,一些实力雄厚的啤酒厂往往将废弃的酵母泥加工成单细胞蛋白饲料加以出售,但浪费了宝贵的RNA资源,而一些中小型啤酒厂则直接将废弃酵母泥丢弃,这更是巨大的资源浪费,同时还污染环境,特别是对水体污染的后果极为严重。综合利用废弃啤酒酵母泥提取RNA,不仅可以增加经济效益,还能解决环境污染问题。RNA是存在于细胞内的物质,啤酒酵母细胞壁较为坚韧,必须经过破壁处理才能提取RNA。为此,本文采用食盐破壁法和高压均质破壁法提取废弃啤酒酵母RNA,以期为从废弃啤酒酵母中提取RNA积累技术资料。1材料和方法1.1碘的食用级啤酒废弃酵母泥由重庆啤酒厂提供;不含碘的食盐;盐酸食用级,95%乙醇分析纯。高压均质机上海申鹿机械厂;压力消毒锅;水浴埚;恒温烤箱;电子天平。1.2酵母泥的制备参照GB5009.3-2003方法。将废弃啤酒酵母泥用自来水进行淘洗离心,至离心上清液基本无色为止,用玻璃称量皿称取一定质量的淘洗干净的酵母泥置于恒温烤箱中70℃烘烤干燥至恒重,计算含水量。1.3离心提取法食盐破壁法提取啤酒酵母RNA的原理是先通过盐溶液改变酵母细胞的渗透压使其膨胀,再加热使细胞破裂而释放出RNA,利用RNA溶于水的特点,通过调节pH值,使其沉淀下来,洗涤离心收集得到RNA。简要操作方法:称取适量淘洗干净的酵母泥,根据其含水量折算成干酵母重量,加入适量的水使其浓度为8%,选择食盐浓度、加热温度、加热时间和沉淀pH等四个条件参数采用4因素2水平正交方法设计实验。加热完成后,冷却离心,取上清液调pH值,置室温下沉淀过夜,离心获得RNA沉淀,加入适量95%乙醇洗涤2次,置60℃恒温干燥至恒重,计算RNA提取率。计算公式:提取率(%)=提取的RNA干重(g)/酵母的干重量(g)×100%1.4酵母和食盐沉淀实验高压均质破壁法提取啤酒酵母RNA的原理是先通过盐溶液改变酵母细胞的渗透压使其膨胀,再利用高压均质破坏酵母细胞壁结构而释放出RNA,RNA沉淀原理同食盐破壁法。简要操作方法:称取适量淘洗干净的酵母泥,根据其含水量折算成干酵母重量,加入适量的水和食盐使酵母和食盐浓度均为8%,选择均质压力和均质次数作为条件参数采用2因素2水平正交方法设计实验。均质完成后,冷却离心,取上清液调pH值,置室温下沉淀过夜,离心获得RNA沉淀,加入适量95%乙醇洗涤2次,置60℃恒温干燥至恒重,计算RNA提取率。1.5rna纯度的测定参照文献的定磷法进行测定。准确称取RNA粗提物样品0.1g于50ml烧杯中,加入适量6%氨水溶解,用50ml容量瓶定容备用,分别测定总磷和无机磷的含量,计算RNA的纯度。计算公式:RNA纯度(%)=(总磷-无机磷)×10.5(g)/RNA样品重量(0.1g)×100%RNA为含磷的有机化合物,含磷量为9.5%,即RNA的重量为所测得的有机磷含量的10.5倍。2结果与讨论2.1可生产酵母泥经测定本实验中所使用的废弃啤酒酵母泥含水量为77%。据报道啤酒厂每生产1万吨啤酒可产生150吨的废弃啤酒酵母泥,据此推算可得到30余吨的干酵母,以此作为原料提取RNA可以增加经济效益。2.2不同加热时间和沉淀ph对rna提取率的影响表1为正交试验因素水平表,表2为3次重复实验的平均值。由表2可知,在本实验所选因素条件下,以盐浓度为8%,加热温度为121℃,加热时间为30min,沉淀pH为2时,RNA提取率最高,为2.21%。文献报道废弃啤酒酵母泥的RNA含量在4.5%～6.5%之间(研磨破壁法测定),因RNA沉淀需要一定的RNA浓度和颗粒密度,而本实验采用破壁后直接提取RNA,RNA在溶液中的浓度较低,沉淀效果可能受到一定影响,如果对离心后的上清液进行适当的浓缩处理后再进行沉淀,可能会有助于提高RNA的提取率。2.3均质次数对提取率的影响表3为正交试验因素水平表,表4为3次重复实验的平均值。由表4可知,在本实验所选的因素条件下,以均质压力为70MPa,均质次数为3次时,RNA的提取率最高,为3.08%。高压均质法利用高压下产生强烈的剪切、撞击和空穴作用使酵母细胞壁结构破坏,在一定的压力和重复次数下均质,可以达到较好的破壁效果。从本实验结果还可以看出,高压均质法提取啤酒酵母RNA的得率高于食盐破壁法的得率,结合工艺条件分析,高压均质法更适合于工业化生产。2.4啤酒酵母rna提取物纯度通过定磷法对食盐破壁法和高压均质法提取的啤酒酵母RNA粗提物纯度测定结果表明其纯度在81.2%～86.7%之间,两种提取方法均可获得较高纯度的酵母RNA。3高压均质法提取法3.1食盐破壁法提取啤酒酵母RNA的工艺中,以盐浓度为8%,加热温度为121℃,加热时间为30min,沉淀pH为2时,RNA提取率最高,为2.21%。高压均质法提取啤酒酵母R