靶向微小rna的肿瘤干细胞治疗研究进展

靶向微小rna的肿瘤干细胞治疗研究进展

最小钠（mirna）是一个细长的非碱基对称剂，具有21.23个碱性氨基酸。碱基对靶基因mrn的3'非翻译区域的碱基进行了反应，并通过对反应生物体mrn的反应来阻碍其翻译。肿瘤细胞的多种生物学行为受miRNA的调控,其功能涉及细胞的分化、增殖、凋亡、耐药、侵袭及转移等。随着肿瘤干细胞学说的建立,研究认为肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSCs)是肿瘤治疗失败和复发的根源,在此过程中miRNA也参与了CSCs多个重要生物学行为的调控。阐明CSCs相关miRNA的生物学功能将为进一步发掘以miRNA为靶点的CSCs治疗提供新的理论依据和途径。1cscs在细胞、其它组织中的生长早在2000年,Weissman等提出肿瘤干细胞学说认为,肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞特性的CSCs,是肿瘤形成并不断进展的根源。CSCs的致瘤能力远远超过其他肿瘤细胞,甚至仅接种50个CSCs即可在动物体内形成肿瘤。CSCs具有无限增殖、自我更新、分化潜能、侵袭转移、放化疗耐受以及高致瘤特性。目前,已在乳腺癌、前列腺癌、脑部肿瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌及肝癌等多种恶性肿瘤中找到了CSCs存在的证据。由于传统的放化疗很难杀灭CSCs,肿瘤的复发无法避免,这也成为肿瘤无法治愈的重要原因。肿瘤干细胞学说从肿瘤内部细胞之间的差异来进一步认识肿瘤,从而为研究肿瘤开辟了一个新的视野,对改进肿瘤现有的治疗策略产生深远影响,发掘针对CSCs治疗的新途径将使肿瘤的根治成为可能。2mirna在肿瘤治疗中的作用新的观点认为,肿瘤可能是一种干细胞疾病,CSCs由于其独特的治疗不敏感特性而增加了临床治疗的难度。近年来研究显示,miRNA在多种肿瘤的CSCs中异常表达,通过影响相应靶基因的表达来调控CSCs的恶性生物学行为(表1)。未来的肿瘤治疗将更加强调针对CSCs的治疗,对这些异常表达的miRNA进行广泛深入的研究将为CSCs治疗开辟一条新的途径。2.1mir-30通过调控细胞的致瘤和肺转移作用乳腺癌和卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤,研究发现其中的CSCs恶性表型的维持与异常表达的miRNA密切相关。CSCs可以在无血清培养液内呈非黏附性球形生长,形成具有干细胞特性的肿瘤球。Yu等发现,乳腺癌肿瘤球富含CD44+/CD24-干细胞,且细胞let-7的表达明显降低,let-7能够抑制乳腺癌干细胞的增殖、致瘤、肿瘤球形成及转移能力。let-7通过负调控H-RAS的表达降低乳腺癌干细胞的自我更新能力,通过抑制HMGA2(highmobilitygroupA2)的表达来促进细胞分化,表明let-7能够通过不同的机制共同抑制CSCs的恶性行为。Shimono等在CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞中发现了37个表达异常的miRNA,其中miR-200c-141、miR-200b-200a-429和miR-183-96-182表现出一致的下调。miR-200c-141和miR-200b-200a-429同属于miR-200家族,miR-200c负调控BMI1(BlymphomaMo-MLVinsertionregion1homolog)的表达,使乳腺癌干细胞的成瘤能力明显降低,细胞失去了自我更新和增殖能力。Yu等发现,乳腺癌CD44+/CD24-或无血清培养的肿瘤球细胞中miR-30低表达,miR-30通过抑制Ubc9(ubiquitinconjugatingenzyme9)和整合素β3(integrinβ3,ITGB3)的表达分别调控干细胞的自我更新和凋亡,高表达miR-30抑制乳腺癌干细胞的致瘤和肺转移能力。Wang等发现,来源于乳腺癌BT474、MDA361和MCF-7细胞的肿瘤球细胞中miR-181家族的表达明显上调,miR-181a通过调控其靶点毛细血管扩张性共济失调突变(ataxiatelangiectasiamutated,ATM)基因的表达来维持细胞的部分干细胞特征。在肿瘤不断进展中,CSCs分化出来的子代癌细胞也呈现出部分干细胞特性,这可能也是肿瘤治疗失败的一个原因。Guttilla等发现,MCF-7细胞经过长时间(5周)无血清培养后再恢复常规培养获得的细胞群[作者命名为MCF-7(M)细胞]中大部分细胞呈现稳定CD44+CD24-/low干细胞样表型,同时细胞具有更高的侵袭、增殖和致瘤能力以及化疗耐药性,通过与其亲代MCF-7细胞的miRNA表达谱对比发现:miR-200c、miR-203和miR-205表达降低,而miR-222和miR-221表达增高,但这些异常表达的miRNA在乳腺癌干细胞及其分化过程中的作用还有待进一步研究。在卵巢癌的研究中,Yin等发现卵巢癌CD44+细胞的miR-199a和miR-214的表达明显低于CD44-细胞,CD44-细胞高表达miR-199a和miR-214,导致相应靶点κB抑制蛋白激酶β(inhibitorofkappaBkinasebeta,IKKβ)和10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10,PTEN)表达降低,抑制核因子κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)信号通路,细胞对化疗及肿瘤坏死因子α(tumournecrosisfactoralpha,TNF-α)敏感性增加,但Akt信号通路激活,细胞处于快速分裂状态,而卵巢癌CD44+干细胞呈低分裂、Akt信号通路失活与NF-κB信号通路激活状态。Cheng等发现,miR-199a能够负调控卵巢癌CD44+/CD117+细胞的CD44表达,过表达miR-199a抑制了卵巢癌CD44+/CD117+细胞的增殖、侵袭、转移以及体内成瘤能力,细胞出现G2/M期阻滞,同时对顺铂、多柔比星和紫杉醇的敏感性增加,细胞的其他干细胞相关标志物ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-bindingcassettesub-familyGmember2,ABCG2)、Nanog、Oct4、CD133及CD117的表达也受到明显抑制,表明miR-199a抑制干细胞恶性表型的效应是多因素共同作用的结果。在CSCs分选方法中,侧群(sidepopulation,SP)细胞分选法获得的SP细胞也具有干细胞特性并富含CSCs。Misawa等发现,在乳腺癌BSY-1、HBC5、MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞来源的SP细胞中miRNA-21表达水平明显增高,抑制miR-21的表达可提高HeLa-SP和MCF-7-SP细胞对拓扑替康的化疗敏感性,同时抑制细胞的克隆形成能力。在胃癌CSCs的研究中,针对miRNA的研究逐渐开展。Ji等发现,miR-34通过负调控HMGA2、Notch和Bcl-2等基因来抑制CSCs的自我更新。Golestaneh等分析含有CD443’非翻译区结合位点的4个miRNAs(miR-302a、miR-372、miR-373和miR-520c-5p)、let-7和miR-21在CD44+的胃癌MKN-45细胞中的表达情况,结果发现与CD44-细胞比较,miR-21和miR-302表达水平增高,而let-7a表达水平降低,CD44+细胞未能检测到miR-372、miR-373和miR-520c-5p的表达,因而研究这些差异表达的miRNA在CSCs中的作用将有助于发掘治疗胃癌的新靶点。2.3mir-1333在肺癌细胞中的表达肝癌与胰腺癌均为放化疗不敏感型肿瘤,临床尚缺乏有效的治疗方案,随着对肿瘤干细胞和miRNA的研究开展,可能对提高这类肿瘤的临床疗效提供新的思路。研究显示,一些干细胞标志物(如Sox2、Oct4和Klf4)受miR-145的调控。Jia等发现,肝癌干细胞中miR-145表达明显降低。MiR-145通过负调控Oct4抑制干细胞的多个恶性表型(肿瘤球形成、致瘤能力和细胞周期阻滞)。Zhang等分析肝癌CD133+细胞miRNA表达谱(5个下调,9个上调)发现,miR-150能够负调控c-Myb的表达,降低肝癌SMMC-7721细胞中CD133+细胞的比例,可促进细胞出现周期阻滞和凋亡,同时细胞的生长及肿瘤球形成能力均受到显著抑制。Ji等对具有干细胞特性的肝癌上皮细胞黏附分子+(epithelialcelladhesionmolecule+,EpCAM+)/甲胎蛋白+(alphafetoprotein+,AFP+)细胞群研究发现,miR-181和miR-17-92家族表达明显增高,miR-181能够提高肝癌细胞中EpCAM+细胞的比例,而抑制miR-181表达后肝癌HuH1细胞的肿瘤球形成能力以及HuH1-EpCAM+细胞的致瘤能力明显降低;荧光报告基因分析发现,miR-181能够通过负调控CDX2(caudaltypehomeobox2)、GATA结合蛋白6(GATA-bindingprotein6,GATA6)和Nemo样激酶(NEMO-likekinase,NLK)的表达来发挥作用。在胰腺癌的研究中,Ji等发现胰腺癌MiaPaCa2细胞中呈现典型干细胞特性的CD44+/CD133+细胞低表达miR-34a/b/c。MiR-34a能够明显降低CD44+/CD133+细胞的比例,同时细胞的肿瘤球形成能力明显降低;进一步研究显示,miR-34a通过负调控Bcl-2的表达而发挥抑癌基因样作用。其他研究显示,let-7b及miR-26a能够抑制胰腺癌干细胞球的形成和增殖能力。为高通量分析胰腺癌干细胞的miRNA表达谱,Jung等对3株胰腺癌细胞(Capan-1、HPAC和hYGIC6)来源的肿瘤球细胞进行miRNA表达谱分析,发现有210个表达异常的miRNA;对其中的6个miRNA进一步采用实时定量PCR检测发现,miR-99a、miR-100、miR-106a和miR-125b表达明显下调,而miR-192和miR-429表达上调,提示CSCs受众多miRNA的调控,进一步研究这些异常表达的miRNA的生物学效应将有助于揭示miRNA在CSCs中的作用。2.4mir-赋予小鼠放疗及化疗的能力肺癌是当今肿瘤死亡的首要原因,在对肺癌CSCs不断认识的过程中,对miRNA的研究也取得了一些进展。Chiou等发现,肺腺癌SP细胞或CD133+细胞群中miR-145表达水平明显降低,miR-145抑制了肿瘤的生长和转移,提高放疗及化疗(紫杉醇、表柔比星、5-氟尿嘧啶和顺铂)的敏感性,荷瘤小鼠的生存时间明显延长。Xu等发现,肺癌SP细胞中9个miRNA表达上调,25个miRNA表达下调。上调≥4倍的miRNA为miR-548、miR-498、miR-1281及miR-940,下调≥4倍的miRNA有miR-98、miR-31*、miR-16-2*、miR-15b*、let-7e、miR-26b、let-7c、miR-125a-5p及miR-20b,但是这些异常表达的miRNA在肺癌干细胞中所具有的功能大部分还不清楚。2.5cd133+细胞的转染mir-赋予了细胞活力目前,CD133常被用作脑部肿瘤CSCs的分选标志物,现已发现包含胶质瘤在内的脑部肿瘤CSCs中有多个miRNA的异常表达。Yang等研究发现,在胶质瘤CD133+细胞中miR-145的表达水平明显降低。CD133+细胞高表达miR-145后,导致其靶点Oct4和Sox2继发性表达抑制,细胞的增殖、克隆、侵袭、肿瘤球形成能力及致瘤性均受到抑制。不仅如此,CD133+细胞转染miR-145后的细胞基因表达谱呈现与CD133-细胞相似,耐药基因(MDR1、ABCG2及ABCB5)及抗凋亡基因(Bcl-2与Bcl-xL)的表达下降,Bax基因表达增高;体内外研究显示,miR-145能够抑制荷CD133+细胞小鼠肿瘤生长,提高放疗和(或)替莫唑胺的疗效。另有研究发现,miR-128通过靶向抑制BMI1的表达而抑制胶质瘤干细胞的更新、增殖和肿瘤生长。Gal等发现,胶质瘤CD133+细胞中miR-451、miR-486和miR-425表达下降,但其功能还有待进一步研究。在成髓细胞瘤的研究中,Garzia等发现稳定表达miR-199b-5p的人成髓细胞瘤Daoy细胞中CD133+细胞的比例明显减少,miR-199b-5p通过负调控HES1(hairyandenhancerofsplit1)基因的表达而抑制肿瘤细胞的增殖、生长和进展。2.6cd54的表达MiRNA在前列腺癌及头颈部癌的CSCs中也发挥了很重要的作用。Liu等发现,在前列腺癌细胞(LAPC9、LAPC4与Du145)及其组织标本中分选出的CD44+细胞及LAPC4-CD133+细胞中,miR-34a的表达明显降低,miR-34a通过负调控CD44的表达来抑制CD44+细胞的生长和转移。Lo等研究发现,乙醛脱氢酶1+(aldehydedehydrogenase1+,ALDH1+)/CD44+的头颈部肿瘤细胞呈现miR-200c低表达,miR-200c负调控BMI1的表达,从而抑制ALDH1+/CD44+细胞的克隆形成和侵袭,提高ALDH1+/CD44+细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇和表柔比星以及放疗的敏感性,降低其在体内的致瘤能力及肺转移能力,提高荷瘤小鼠的生存率。3mirna的作用机制当今研究认为,肿瘤也是一种信号通路疾病,肿瘤干细胞也呈现出多条信号通路的异常激活和(或)失活,针对单一信号通路的治疗还不能从根本上治愈肿瘤。随着肿瘤干细胞学说的建立,人们已经意识到CSCs将是治疗肿瘤的一个理想靶点。研究发现,miRNA在众多肿瘤的CSCs中发挥着重要的作用,而且miRNA能够通过抑制多个靶基因表达的同时调控肿瘤的多条信号通路,最终降低CSCs的数目并逆转其恶性表型。因此,以miRNA为治疗靶点的治疗策略将成为CSCs治疗的一个新的途径,使治愈肿瘤逐渐成为可能。3.1irna-33a的临床疗效目前,基于脂质体包被载体MaxSuppressorinvivoRNALancerⅡ的核酸负载技术已经应用于实验研究,负载miRNA-34a的复合物通过瘤内或尾静脉注射治疗肺癌动物模型已经显示出较好的疗效以及很低的血液学不良反应和免疫反应。在治疗前列腺癌干细胞的研究中,Liu等发现miR-34a抑制CD44+细胞的肿瘤生长和转移,采用这种脂质体负载miRNA-34a后通过尾静脉注射治疗前列腺癌荷瘤小鼠,肿瘤的生长和转移受到抑制,小鼠的预后明显改善,表明这种治疗策略在CSCs治疗中将具有广泛的潜在应用前景。3.2核酸载体的选择shortbranch-polyethylenimine,PU-PEI)介导的miRNA治疗随着高分子材料的发展,已有一些可生物降解的生物材料成为基因治疗的体内安全输送核酸的载体,由于其独特的物理特性,能够保护导入过程中的核酸免受核酸酶的降解,提高了输送效率和治疗效果。Chiou等和Yang等使用高分子生物材料PU-PEI包被miR-145表达质粒,构建PU-PEI-miR-145复合物用于治疗肺癌及胶质瘤干细胞,通过瘤内注射方法治疗荷肺癌及胶质瘤干细胞的小鼠,发现PU-PEI技术介导的miR-145表达能够抑制肿瘤干细胞的生长和转移,提高放化疗敏感性,延长荷瘤小鼠的生存时间。3.3甲双fig对胰腺细胞中mirna表达的调控最新研究显示,一些传统药物也能够通过调控miRNA来抑制CSCs的恶性行为,这为肿瘤的防治提供了新的手段。Bao等在研究降血糖药二甲双胍对胰腺癌干细胞的抑制作用时发现,二甲双胍能够增加胰腺癌细胞let-7a、let-7b、miR-26a、miR-101、miR-200b和miR-200c的表达,其抗肿瘤作用可能与调控这些miRNA有关。Nalls等研究发现,甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷及组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA能够抑制胰腺癌干细胞的恶性表型,同时还能够诱导miR-34a的表达,并且该抗肿瘤效应能够被miR-34a抑制剂所拮抗,提示其对胰腺癌CSCs的作用可能是通过miR-34a调控其相应的靶点实现的。4以mirna为治疗/调控靶点的cscs治疗存在的问题综上所述,miRNA已在多种肿瘤的CSCs中发挥着重要的作用,肿瘤CSCs的恶性表型维持需要众多miRNA的参与,阐明它们的作用将有助于更全面深入地认识肿瘤发生和发展的分子机制。目前,以miRNA为治疗/调控靶点的CSCs治疗的实验研究已经开展,但在取得治疗成功之前还有很多问题需要解决,如:miRNA对CSCs的效应是否具有组织特异性,哪些miRNA参与CSCs的调控,它们之间组成什么样的调控网络,miRNA对体内正常组织细胞的作用如何,m