自噬是一种生理机制

自噬是一种生理机制

自食（自我消化）是通过降低自身的细胞和细胞器官进行一系列生化过程，以实现真核细胞的“自我消化”。在这个过程中,首先是细胞质和细胞器被双层膜包裹形成自噬泡,然后再与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最终使被包裹的细胞质和细胞器降解。自噬主要有3个功能:①自噬是对营养缺乏的一种适应性的反应。当营养缺乏导致细胞内氨基酸减少时诱导自噬的发生,以维持细胞的正常代谢。②自噬参与稳定细胞质内环境的管理。它控制过氧化物酶体、线粒体和内质网的更新。③自噬参与一定的组织特异性融合。自噬既可以作为一种防御机制来抵御环境变化对细胞造成的损伤,同时它作为一种细胞的死亡程序,又可以诱导细胞主动性的死亡。这种双重机制使其在肿瘤细胞中也产生不同的作用。作为Ⅱ型的程序性细胞死亡——自噬,在某些时候与Ⅰ型程序性细胞死亡——凋亡有着密不可分的联系,这就使在研究抗肿瘤药物诱导细胞自噬时也必须考虑这些因素。1肿瘤细胞的自排斥1.1突变前后肿瘤细胞的自噬能力和细胞系统的变化从上世纪70年代末期开始,人们逐渐认识到肿瘤细胞的自噬能力低于同样部位正常细胞的自噬能力,而且在营养缺乏或者细胞高密度的情况下,肿瘤细胞的自噬能力也不会增加。这就使人们将细胞自噬能力的减少同肿瘤的发生联系了起来。随后,在肿瘤的动物模型中也观察到了这种现象。在对不同肿瘤细胞发展过程的研究中发现,有些肿瘤细胞,如化学致癌物导致的肝癌细胞,在癌变前期的肝结节时就已经出现了自噬能力下降的现象。而鼠的胰腺细胞经致癌物质诱导后,在癌变前期的结节和形成腺瘤的时候自噬和降解能力是增加的,当形成癌细胞时,自噬能力反而减少。这些例子说明大多数肿瘤细胞(如:肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同,但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬能力的衰退可能有利于肿瘤的发展。这提示肿瘤细胞之所以能快速生长,是由于它打破了细胞蛋白质合成速率与自噬体降解蛋白质的平衡。为此,越来越多的研究者从诱导细胞自噬的角度去观察抗肿瘤药物作用的分子机制。1.2血清/氨基酸的浓度尽管大多数肿瘤细胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些肿瘤细胞保持了较高的自噬活性,如大肠癌、肺癌细胞及人宫颈癌HeLa细胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h,HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用,也可能使一些抗肿瘤药物的作用减弱。2对药物过程导致细胞凋亡的机制虽然目前知道一些抗肿瘤药物可以诱导细胞自噬的产生,但是由于自噬的双重机制以及自噬和凋亡之间的密切联系,从而对于某些药物最终导致细胞死亡的分子机制尚不能肯定。2.1由于自蚀激活，肿瘤细胞死亡2.1.1胞自噬作用如:他莫昔芬(tamoxifen)对乳腺癌MCF-7细胞产生的自噬作用。苦参碱(matrine)可以引起肝癌细胞HepG2形成自噬小体。盼生安(panshengan)对BEL-7402肝癌细胞的作用中也可看到自噬的产生。2.1.2氧化二砷诱导凋亡如:三氧化二砷(As2O3)在低浓度(2μm)时,诱导恶性神经胶质瘤细胞死亡方式是自噬,这一浓度还不会出现骨髓抑制和严重的副作用。而三氧化二砷在高浓度时(8～16μm)则是通过诱导凋亡导致细胞死亡。对于APL(急性早幼粒细胞白血病)细胞系,低浓度的三氧化二砷(1μm)就诱导了它们的凋亡。同样,白藜芦醇(resveratrol)在低浓度时(50μm),通过诱导卵巢癌细胞的自噬导致细胞死亡,而它杀死前列腺癌细胞的作用主要是通过凋亡途径。2.1.3诱导肿瘤细胞自噬长春新碱(vincristine)可以诱导肝癌细胞HepG2的自噬性凋亡。这种细胞凋亡有着明显的自噬特征。据报道,长春碱类抗肿瘤药可诱导肿瘤细胞自噬的发生,也能诱导肿瘤细胞凋亡。同样,芦荟大黄素(aloeemodin)在对鼠的C6神经胶质瘤细胞的作用中,除了可以引起caspase依赖性的凋亡外,还可促进胞质内酸性囊泡的形成,这说明了在芦荟大黄素的作用下,鼠的C6神经胶质瘤细胞也可以进行自噬性的死亡。2.2诱导细胞增殖自噬作用既可以启动自噬性的死亡程序抑制肿瘤的发展,同时它也是肿瘤细胞的一种适应性反应,保护肿瘤细胞,防止营养缺乏和药物带来的损害。在已知的可以产生自噬作用的抗肿瘤药物中,大部分药物在适当浓度(诱导自噬的产生)时就可以抑制肿瘤细胞的增殖,诱导它们死亡。但是有一些药物在可以诱导细胞产生自噬的浓度时,并没有引起细胞的死亡。如temozolomide(替莫唑胺),是一种新的烷化剂,用其处理恶性神经胶质瘤细胞U373-MG时发现有自噬产生。使用浓度为100μm的temozolomide,3d后,可以看到U373-MG细胞中有明显的自噬特征,而且细胞的增殖受到抑制。但作用7d后却发现细胞开始增殖。这说明了该物质诱导的自噬是可逆的,而且这种自噬可以保护肿瘤细胞,防止其死亡。由于自噬在肿瘤细胞中具有双重机制,因此,在研究抗肿瘤药物时,要从正反两方面去看待肿瘤细胞所产生自噬作用。2.3口皮细胞自噬,所见表4研究发现有些抗肿瘤药物也能诱导正常细胞的自噬。如5-FU(5-氟脲嘧啶)可以诱导口腔上皮角质化细胞的自噬,通过自噬降解使正常的上皮细胞发生变化,这可能与5-FU这类化疗药会引起机体的不良反应之——粘膜炎有关。3bnip3和lc3在肿瘤形成的过程中,参与细胞自噬调控的多种基因发生异常,从而导致细胞自噬能力的下调。抗肿瘤药物可以通过调整这些异常的基因提高肿瘤细胞的自噬。如:Beclin-1是酵母Atg6/Vps30的同系物,能和Atg14,Vps34/class3PI3kinase,Vps15共同形成一个多聚体复合物.这个复合物在自噬体的形成过程中起到一个关键的作用。Beclin-1作为一种哺乳动物的自噬基因,可以控制细胞的生长,抑制肿瘤的发生。这一作用的产生与它包含有丰富亮氨酸核输出信号的结构域有关。在40%～75%的弥散性乳腺癌和卵巢癌细胞中,都有Beclin-1的单等位基因缺失。在乳腺癌MCF-7细胞中,增加Beclin-1的表达可以促进自噬,抑制MCF-7细胞的增殖。使用他莫昔芬处理MCF-7细胞后发现,可以增加Beclin-1的表达,这也从分子机制上论证了他莫昔芬可以诱导细胞自噬的产生。作为Bcl-2家族中的一员,BNIP3(Bcl-2/腺病毒E1B19-ku相互作用蛋白3),它拥有Bcl-2同源3功能区,在细胞被诱导发生死亡的过程中,它能够完全与线粒体的外膜整合,引起线粒体通透性的转运孔开放,它的高表达可以引起肿瘤细胞发生Ⅱ型细胞程序性死亡——自噬性死亡。因此在三氧化二砷诱导的恶性神经胶质瘤细胞自噬性死亡的过程中,BNIP3发挥着重要的作用。三氧化二砷是通过上调线粒体的细胞死亡蛋白BNIP3,来诱导恶性神经胶质瘤细胞自噬性死亡。LC3(微管相关蛋白1lightchain3),最初是从鼠的大脑中与微管相关蛋白1A和1B一起提纯时被发现的,它是酵母Apg8/Aut7p的同系物。在酵母中,Apg8/Aut7p对于自噬体的形成起到了重要的作用。LC3现已作为自噬体的特异性标记蛋白。当哺乳动物的细胞有自噬发生时,LC3-Ⅰ脂质化形成LC3-Ⅱ,定位于自噬体膜,这些定位能够通过和绿色荧光蛋白或其衍生物结合,形成嵌合蛋白来进行观测。使用抗肿瘤药物处理肿瘤细胞时也可以看到这一现象。如用长春碱(vinblastine)处理饥饿的HeLa细胞时,可以看到,LC3的量比不用该药处理时产生LC3的量明显增多。在用temozolomide处理恶性神经胶质细胞瘤细胞后,发现LC3-阳性自噬泡数量也明显增多。这不仅说明了这些抗肿瘤药物可以激发肿瘤细胞的自噬,同时也指出了这些肿瘤药物参与了自噬分子的调控。TOR(targetofrapamycin)蛋白属于磷脂酰激酶相关激酶(PIKKs)家族,它可以调节翻译的启动和延长、核糖体的生物合成、氨基酸的转运、与代谢途径有关的酶的转录和自噬。TOR通过感受细胞内氨基酸和ATP的量来调节自噬,因此又被认为是自噬启动的门户。它活化时抑制自噬的发生。雷帕霉素(rapamycin)可以抑制TOR的活性,从而诱导细胞自噬。雷帕霉素是一种抗真菌药物和免疫抑制剂,同时它还具有抗肿瘤的活性,现在正在对癌症患者进行Ⅱ期和Ⅲ期的临床试验。已经有研究证实雷帕霉素和它的派生物(CCI-779,RAD001andAP23576)在多种恶性肿瘤中可以抑制mTOR(mammaliantargetofrapamycin)的功能,并且产生抑制细胞增殖的作用。至于雷帕霉素是否可以直接诱导肿瘤细胞的自噬,目前还未见相关报道。研究抗肿瘤药物参与自噬的分子调控,有助于进一步了解自噬与抗肿瘤药物之间的关系,也为研究抗肿瘤药物的作用机制开辟了一个更为广阔的空间。4常见的抗肿瘤药物近年来,随着分子生物学的进步和分子药理的深入探索,为恶性肿瘤的药物治疗提供了不少新靶点,抗肿瘤药正从传统的细胞毒药物向针对多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。其中一些具有新靶点的抗肿瘤药与自噬也存在着一定的关系。4.1内皮细胞间的相互作用肿瘤内的血管是新生的,肿瘤可通过这些新生的血管实现肿瘤间质的血管化,并在肿瘤的生长和扩散中起重要的作用。近年来肿瘤新生血管生成抑制剂已成为抗肿瘤药的新靶点。肿瘤内出现血管后,除了血管带给瘤细胞营养外,内皮细胞本身对瘤细胞也有旁分泌刺激作用。肿瘤新生血管的旁分泌效应源于内皮细胞产生的生长因子和细胞因子,它们刺激肿瘤细胞生长和转移。Endostatin(内皮抑素)通过抑制内皮细胞增殖,阻止血管生成而发挥抗肿瘤作用。Chau等通过体外实验证实,用Endostatin诱导EAhy926人内皮细胞的死亡主要是自噬性的死亡。电镜下观察Endostatin作用于人内皮细胞6～24h后就可见大量的自噬泡。Endostatin产生的细胞毒作用不依赖于caspase途径和氧化途径,但可被3-MA(一种特异的自噬抑制剂)和亮肽素,抑酞酶(丝氨酸,半胱氨酸溶酶体蛋白抑制剂)所调控。4.2产生肿瘤细胞自噬肿瘤分化诱导剂可以诱导某些肿瘤细胞分化为正常或接近于正常的细胞,从而使它们出现类似正常细胞的表型或恢复正常细胞的某此功能。但是这些分化诱导剂也可以引起某些肿瘤细胞发生自噬现象。如:维生素D(VitaminD)和类似物可以诱导处于G1/G2期的白血病细胞向成熟阶段分化,阻遏细胞进入S期。同时它们还能抑制乳腺癌细胞和结肠癌的生长。在研究VitaminD的类似物EB1089对乳腺癌MCF-7细胞的作用时发现,它杀死MCF-7细胞时并不依赖于caspase,但是它也能引起染色质凝聚和DNA断裂。实验证实,在EB1089的这种启动核凋亡的作用中包括了依赖Beclin1的自噬途径。4.3crolxin抑制剂细胞信号在传导过程中发生障碍或异常就会导致恶性肿瘤增殖、无限生长。细胞信号转导的靶点包括信号蛋白构象、配基受体结合信号蛋白以及细胞信号转导过程中的关键酶等。表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶受体,它在乳腺癌、卵巢癌、喉癌、食道癌、脑肿瘤等中都有过量表达。响尾蛇毒(crotoxin)为美洲响尾蛇毒液的提取物,Nicholas等使用了不同的鳞状癌细胞(这些癌细胞表达EGFR水平不同)来观测crotoxin对它们的抑制作用,发现crotoxin抑制高表达EGFR的细胞生长最有效。从而说明了crotoxin对高表达EGFR的肿瘤细胞有高度的选择性抑制作用。由于其对多种肿瘤细胞有作用,现在正在对患有实体瘤并且用常规治疗难以控制的病人进行Ⅰ期临床试验。我们实验室使用crotoxin处理慢性粒细胞白血病细胞K562和人乳腺癌细胞MCF-7时发现,它在引起这两种细胞死亡的过程中启动了自噬。5出现非自噬的药物自噬是一种生理机制,它在抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的过程中也会发生。抗肿瘤药物引起肿瘤细胞发生自噬与药物的种类、肿瘤细胞的类型、药物的浓度、药物作用细胞的时间等因素有关。由于自噬的特点,药物诱导肿瘤细胞产生自噬后会出现两种不同的结果:一种是保护细胞防止周围环境带来的损害;另一种是启动细胞主动性的Ⅱ型细胞死亡程序。目前,对于这两种不同结果的