嗜杀酵母特性及其在发酵生产中的应用

嗜杀酵母特性及其在发酵生产中的应用

1973年，贝瓦尔在种植甘蔗后发现了一种残忍的酒发酵母。在生长和繁殖过程中，他们可以在校外分泌蛋白质或糖蛋白，即酒精，从而杀死或抑制野生菌。它具有净化发酵系统、快速发酵速度快、凝集性好等特点。不仅为纯栽培提供了保障，而且还具有提高接种母芽的活力、缩短发芽周期、减少啤酒酸分解、提高产量等功能。因此，受到了高度赞扬。1发酵时期酵母菌的分离嗜杀酵母也称杀伤酵母。自从首次在S.cerevisiae中发现嗜杀菌株后,在其他酵母属和很多自然环境中也发现有大量嗜杀菌株存在,已知的嗜杀酵母按其嗜杀性至少可分为11种(K1~K11),其中K1、K2、K3主要存在于酵母属(Saccharomyces)中。嗜杀酵母也存在于汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、有孢汉逊氏酵母属(Hanseniaspora)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和隐球酵母属(Cryptococcus)中。Hidalgo等在马德里的11个葡萄酒酿造厂分离出270个酿酒酵母菌株,结果发现其中具有嗜杀表现型的占42.6%,并且不同发酵时期具有嗜杀活性的菌株所占比例不同,初期为18.8%,中期升至50%,晚期达58.8%。王贵双从不同来源的果汁中分离的200株酵母菌中有14株具有嗜杀活性,其中有2株还表现出良好的苹果汁发酵性能。Dabhole等从印度几种药用植物的花中分离出来的嗜杀酵母对敏感酵母和真菌病原体都有杀死和抑制作用,能耐高糖,也适用于酿酒工业。2酵母嗜杀活性与质粒及染色体的关系嗜杀酵母主要通过分泌毒素蛋白对敏感野生酵母起到嗜杀作用,对酵母嗜杀因子的本质及机理的研究发现嗜杀活性除了与dsRNA有关外,某些酵母的嗜杀活性还与质粒DNA以及染色体DNA相关。2.1菌株编码毒素a、c、cerevira质粒的主要结构据报道,嗜杀酵母中含有多种dsRNA,但其嗜杀活性仅与分子量为1.0×106Da~1.7×106Da的M-dsRNA和分子量为2.5×106Da~3.0×106Da的L-dsRNA2种类型的dsRNA有关。不同的嗜杀酵母菌株中含有不同的M-dsRNA质粒,编码合成和分泌不同的毒素蛋白,表现出不同的嗜杀表型。M-dsRNA质粒只能从具嗜杀活性的酵母细胞中检出,敏感酵母及嗜杀现象消除的菌株中均不存在M-dsRNA质粒,M-dsRNA质粒的存在是嗜杀酵母产生杀伤因子不可缺少的细胞质遗传物质。L-dsRNA的作用是编码自身以及M-dsRNA质粒的主要外壳蛋白。S.cerevisiae是由dsRNA编码毒素决定嗜杀活性的典型例子,对S.cerevisiae嗜杀酵母作用机理的研究也最为透彻。以S.cerevisiae分泌的K1毒素为例,毒素蛋白主要通过影响敏感细胞的细胞壁功能和破坏细胞膜系统对敏感细胞发挥致死作用。首先毒素蛋白与敏感细胞细胞壁上受体结合,然后毒素蛋白被转移到细胞膜上,与敏感细胞的细胞膜上受体结合并发生耗能的反应,此为毒素蛋白发挥致命作用的关键所在。已经有研究证明敏感细胞上细胞壁的主要成分β-1,6-D-葡聚糖是毒素蛋白的主要受体。毒素蛋白是一种糖基化蛋白,能有效作用于葡聚糖,表现出β-葡聚糖酶的活性,抑制敏感细胞壁β-葡聚糖合成,使敏感细胞细胞壁功能受损,导致细胞死亡。待毒素蛋白运送到细胞膜上,它能在敏感酵母细胞的细胞膜中产生离子透过空间,使K+、ATP等物质外泄,从而使蛋白质、核酸等大分子物质在细胞内的合成停止,导致细胞的死亡,这一过程需要能量。当敏感细胞进入稳定期后,代谢逐渐缓慢,能量产生较少,所以对毒素蛋白的敏感性也降低。由于酵母细胞壁上β-葡聚糖合成酶存在于细胞膜上,活性需要ATP支持,当ATP大量泄漏后,β-葡聚糖合成也受阻。2.2种常见嗜杀药物的tr-pc-ms检测乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的嗜杀现象是Gunge等在从多种酵母属中筛选新质粒的过程中发现的,K.lactis嗜杀菌株分泌的毒素可以抑制大量敏感酵母的增长(包括Candida、Kluyveromyces、Saccharomyces、Torulopsis、Zygosaccharomyces),对非嗜杀型的乳酸克鲁维酵母也有嗜杀作用。这种酵母的嗜杀活性与质粒DNA相关。此类嗜杀菌株细胞都包含有pGKL1(分子量为8,874kp)和pGKL2(分子量为13,447kp)2个线形质粒。pGKL1有4个蛋白质编码区(ORF),其中2个编码嗜杀毒素亚基的前体物,另外2个分别与嗜杀毒素的免疫功能和编码DNA合成酶相关。pGKL2的作用是负责2种质粒的自我复制和性状的维持,缺乏pGKL的酵母无嗜杀活性。嗜杀毒素作用于敏感细胞主要通过破坏敏感细胞分裂周期的G1相(DNA合成前期),阻止细胞分裂导致敏感细胞逐渐死亡。毒素蛋白有3个亚基(α、β、γ),γ亚基是破坏G1相阻止敏感细胞分裂的主要结构,最近Lu等发现K.lactis的γ亚基作用于敏感细胞的3种tRNA,导致tRNA结构的断裂而破坏敏感细胞的分裂周期促使细胞死亡。α亚基具有壳多糖酶的活性,嗜杀毒素作用敏感细胞时,可能与细胞壁上的糖类受体如壳多糖发生交互作用,也可能是降解细胞壁上的糖类物质,便于使毒素蛋白进入到敏感细胞中发挥嗜杀作用。β亚基可能同α亚基一起参与毒素与敏感细胞的结合以及毒素分子的跨膜移位过程,便于毒素蛋白进入到敏感细胞后通过γ亚基发挥嗜杀作用。毕赤酵母属(Pichia)中的Pichiainositovora、Pichiapastoris等的嗜杀活性也与质粒DNA相关,嗜杀作用机理与Kluyveromyceslactis类似。2.3酵母嗜杀毒素的耐药机制HM-1是一种由Williopsismrakii分泌的嗜杀毒素,由88个氨基酸组成,其中包含10个半胱氨酸,有较强的耐热性和pH值稳定性,在100℃加热10min或在pH2~11的环境中均不被破坏。HM-1基因存在于染色体DNA中,通过抑制β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性抑制敏感酵母细胞细胞壁的合成,从而导致细胞溶解死亡。由染色体DNA编码的毒素还出现在土生隐球酵母(Cryptococcushumicola)和几乎所有条件致病酵母菌中,例如Candida、Cryptococcus以及Torulopsis,由S.cerevisiae分泌的KHR和KHS毒素也是由染色体DNA编码。酵母嗜杀毒素会受到pH值和温度的影响,通常pH4~5以及温度20℃~25℃时活性最强也最稳定。在果酒发酵过程中嗜杀酵母的嗜杀能力还会受到嗜杀酵母的初始比例、敏感菌株的易感性以及果汁处理方法等各方面影响。Vadasz研究发现敏感酵母在培养基中产生一些黏液分泌物以阻止嗜杀酵母与敏感酵母细胞壁上受体的结合或者影响嗜杀菌株的毒素分泌量,从而降低嗜杀酵母的嗜杀作用力。3发酵菌种的筛选各种野生酵母常会对发酵体系造成污染,嗜杀毒素的产生有利于抑制野生酵母的生长,保证产品的品质。嗜杀菌株对自身分泌的毒素具有免疫能力,但对其他种酵母所产的毒素敏感,不利于在酿酒工业中应用。因此,构建对他种嗜杀毒素有免疫能力且本身也能分泌嗜杀毒素的工业酵母,对于防止发酵体系的杂菌污染是非常有利的解决方法。3.1ssna的提取由于嗜杀酵母本身质粒含量少,且酵母的细胞壁结构导致质粒提取困难。Wickner用蜗牛酶将酵母细胞制成原生质体后提取到dsRNA,由于要完全酶解细胞壁,所需酶量大,不能大量提取,而且还必须除去染色体DNA才能得到目标提取物。秦玉静在不破碎细胞壁的前提下,将嗜杀酵母细胞在碱性条件(pH9.3)下用β-巯基乙醇预处理,再直接用SDS-苯酚抽提完整细胞,分离到了嗜杀质粒,由于细胞壁未破裂减少了染色体DNA的干扰。3.2利用原生质体融合子法制备发酵酵母嗜杀酵母可以从各种酵母属和环境中直接筛选,但是从自然界筛选的野生嗜杀酵母要达到工业大生产的要求就必须进一步的驯化、筛选或利用现代的育种技术进行选育,应用较为广泛的育种手段有诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程和转化技术等。嗜杀酵母的选育多采用原生质体育种技术。王昌禄等利用紫外线致死原生质体融合技术成功的将对紫外线敏感的嗜杀酵母5174菌株的嗜杀质粒转移到酿酒酵母CD4-W中;鲍晓明等通过电融合技术构建了一批嗜杀啤酒酵母,获得的融合子都能有效抵抗野生酵母的污染、保证啤酒纯种酿造。杜连祥等也进行了探索,获得了具有嗜杀活性的啤酒酵母。王金盛等以啤酒酵母2604菌株和K2型嗜杀菌株y(32)为亲本,经原生质体制备、融合获得24株具有嗜杀特性的融合子,最后经嗜杀特性测定、发酵度和双乙酰实验选育出1株编号为Fu-1的嗜杀菌株,具有优良生产性状。刘树英等利用细胞质导入法将核融合缺陷菌株嗜杀酵母5045的嗜杀质粒导入葡萄酒酵母1450中,融合菌株具有抗野生酵母的能力,而且能酿制出优质葡萄酒。杜金华等选择具有核缺陷的嗜杀菌株作为供体,成功地将嗜杀质粒转移到了苹果酵母中,得到了具有嗜杀活性且发酵性能良好的苹果酵母。也有人曾通过原生质体融合技术构建出具有K1、K2杂合嗜杀活性的酿酒酵母,利用融合子发酵所产的酒品质良好。Seki等利用原生质体融合技术将一种嗜杀酵母的ds-RNA转移到酿酒酵母Montrachet522菌株中,在pH4.5的蛋白胨-葡萄糖酵母培养基中,构建的嗜杀酿酒酵母可完全抑制S.cerevisiae敏感酵母的生长,在葡萄汁中起到很好地抑制作用。Sulo构建的K1型嗜杀酵母对敏感酵母和K2型Saccharomyces嗜杀酵母具有嗜杀作用。Michalcakova等建的K2和K3型Saccharomyces嗜杀酵母,对敏感酵母的作用专一性范围较宽,可以在发酵开始时充分地抑制各种敏感酵母的生长。Javadekar等将具有嗜杀活性的S.cerevisiaeNCIM3458的原生质体同具有高絮凝性的S.cerevisiaeNCIM3528的原生质体融合,也构建出具有嗜杀活性的高絮凝酵母,所得的融合子具有较强的酒精发酵能力。Gniewosz通过原生质体电融合技术将S.cerevisiaeBratyslawa菌株和具有K2嗜杀表现型的S.cerevisiaeATCC44069融合,获得的嗜杀酵母具有类似亲本菌株的酿酒特性。基因工程技术能准确的获得目的基因并导入受体细胞中得以表达,此项技术也已成功的用于酵母嗜杀因子的导入。4爱杀鸡在酒精饮料行业的应用4.1发酵过程中的活性酵母的作用葡萄酒发酵是一个复杂的微生物学过程,某些腐败微生物会在发酵的过程中产生一些不良的风味物质,影响酒的品质,在酿酒工业中常通过添加一定量的SO2抑制发酵过程中有害微生物繁殖,减少腐败微生物的危害。Yap从不同的环境中分离出14种已知嗜杀活性的酵母,这些酵母对葡萄酒中典型的S.cerevisiae和非Saccharomyces菌株都有嗜杀作用,嗜杀酵母参与发酵成为酿酒工业中又一种防止腐败微生物的方法。Comitini分离的Kluyveromycesphaffii在葡萄酒酿酒过程中对腐败酵母具有抑制作用。Fleet通过实验也证实,具有嗜杀活性的酵母用于葡萄酒发酵改变了发酵过程的微生物学性质,在果汁发酵过程中呈现自我保护状态,产品质量提高。Zagorc等从Refosk和Teran2种红葡萄酒中筛选得到22种具有嗜杀活性的酵母,将其中4种具有稳定嗜杀活性的S.cerevisiae菌株用于玛尔维萨葡萄汁(Malvasia)发酵中,与自然发酵及常用商业酵母菌株发酵比较,发现筛选出来的SS12/10嗜杀菌株发酵的特性最好,而且发酵的酒风味良好。通过嗜杀酵母和敏感酵母的相互作用还可以加速细胞的自溶,相对于无嗜杀酵母参与的发酵过程,可使更多的蛋白质释放出来,对起泡葡萄酒风味的形成起着重要作用。香蕉是我国南方特产水果之一,营养丰富,但用香蕉酿酒存在的问题是香蕉不易取汁,果胶含量高导致酒质难澄清。刘雁然等对嗜杀活性干酵母在香蕉酒酿制中的应用做了研究,发现使用嗜杀酵母可以净化发酵体系,实现纯种发酵,使酒质稳定;香蕉液可不经过果胶酶除果胶而直接发酵,不仅酒液与沉淀物容易分离,使香蕉酒澄清透明,色泽天然,香味浓郁,还可解决价格昂贵的果胶酶所带来的香蕉酒生产成本高的问题,实现香蕉酒的大规模生产。曾少敏将嗜杀酵母用于芒果酒的酿制中,与一般酒用的高活性酵母对比,嗜杀酵母的利用净化了发酵体系、发酵周期缩短,出酒率提高,酒质稳定,而且酒脚少,易于分离。嗜杀酵母用于苹果酒发酵也能明显改善产品的品质,因此选育嗜杀酵母对于促进酿酒工业的发展有着极为重要的意义。4.2原生质体融合技术在啤酒的生产过程中有害菌会通过不同的环节进入啤酒中,产生与啤酒酵母发酵所不同的代谢产物,使啤酒的风味和稳定性发生变化。杜连祥等、Sulo等、王昌禄等获得的嗜杀啤酒酵母能很好地抑制野生酵母污染,对于啤酒的纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。王正祥等运用原生质体融合和罕见交配法构建的具杀伤能力的啤酒酵母,通过混合发酵实验证明可有效地防止野生酵母的污染。天津轻工业学院对嗜杀酵母用于啤酒生产的效果进行了研究,以青岛啤酒酵母和嗜杀酵母5040为亲本,