生姜复配物的抑菌活性研究

生姜复配物的抑菌活性研究

生姜是我们日常生活中不可或缺的香辛配方。它也是一种常用的中药。它具有解热、镇痛和抗炎作用。作为一种天然药物、食品和保健品的原料，它对人类疾病和药物的使用具有重要的价值。生姜的化学组分很复杂,主要有挥发油、姜辣素和二苯基庚烷及黄酮类化合物,这些化学成分都具较强的防腐、抗氧化作用的能力。仅用生姜作为单一组分的抗氧化剂、防腐剂已有研究,但用生姜和其它无毒组分混合制备更高效的天然生姜复合抗菌剂少见报道。本课题利用生姜提取物为主要原料,分别与茶叶提取物、柠檬酸、抗坏血酸等原料组合为生姜复合抗菌剂,测定对金黄色葡萄球菌、啤酒酵母的抑菌活性,比较其抑菌效果。找到具有更高效能抑菌活性的生姜复合抗菌剂配方,为天然生姜复合抗菌防腐剂的开发应用提供科学信息。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1微生物实验室菌种:金黄色葡萄球菌、啤酒酵母江汉大学生命科学学院微生物实验室提供。试剂:柠檬酸、抗坏血酸、乙醇、氯化钠、氢氧化钠、焦性没食子酸、葡萄糖等均为分析纯,蛋白胨、琼脂、牛肉浸膏等均为生化试剂。1.1.2仪器和试剂721分光光度计上海精密科学仪器有限公司;UV-2401紫外可见分光光度计日本岛津;RE-S2旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;DHP120恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司;SHJ-875净化工作台上海实验仪器厂有限公司;DF110型电子分析天平中国轻工业机械总公司常孰衡器公司;高压灭菌锅。1.2方法1.2.1生姜复合成分的提取和溶液制备1.2.1.索氏提取液的制备准确称量5.00g生姜粉,以100mL的80%乙醇作为提取液,用索氏提取器回流至提取器中液体为无色,过滤,得黄色提取液。平行提取多份,合并提取液,用旋转蒸发仪蒸干称重,再用50%的乙醇作溶剂配制成一定浓度的生姜提取物溶液。1.2.1.茶叶提取物的制备准确称量15.00g茶叶,用300mL的65%乙醇在常温下避光浸泡3天,过滤,得到黄褐色提取液,用旋转蒸发仪蒸干称重,再用50%的乙醇作溶剂配制成一定浓度的茶叶提取物溶液。1.2.1.3抗坏死药物用50%的乙醇作溶剂配制成一定浓度的抗坏血酸溶液。1.2.1.4-酸盐用50%的乙醇作溶剂配制成一定浓度的柠檬酸溶液。1.2.2通过提取生姜提取物中的液体化学成分1.2.2.特征颜色变化初步判断法由于酚类物质可以与某些显色剂发生显色反应,因此可以通过观察特征颜色变化初步判断物质中所含的化学成分,所以利用此方法可以初步定性鉴定出是否有酚类物质。生姜提取液的显色反应见表2。1.2.2.2.光谱性质的测量按1.2.1.1得到的乙醇的生姜提取液,再稀释100倍,测定紫外可见吸收光谱,见图1。1.2.3供试菌的选择经初步研究,生姜复合抗菌剂对细菌抑制作用最强的是金黄色葡萄球菌,对真菌抑制作用最强的是啤酒酵母,故选择的供试菌为金黄色葡萄球菌和啤酒酵母。1.2.3.组分生姜复合抗菌剂总抑菌量的测定以生姜提取物为主要原料,经初步实验后,设计二组分生姜复合抗菌剂的各组组分见表1,各组溶质的总质量为500mg,以质量和浓度换算成体积,溶液取量为mL,取样混合后加无菌水在10mL比色管中定容,得到二组分生姜复合抗菌剂的不同组分相同总浓度的溶液,用于抑菌试验,比较抑菌效果。1.2.3.抑菌能力的测定各种培养基的制备按文献自制。用无菌生理盐水把各种菌种配制成含菌数约为106～107个/L孢子菌悬液。用滤纸片法测定生姜复合抗菌剂的抑菌能力:用无菌吸管吸取0.2mL的菌液加到培养皿平板中,用无菌三角涂棒涂布均匀,用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(D6mm)分别浸入装有复合抗菌剂的试管中,浸泡5min后取出凉干,每一培养皿平板贴4或5片;再将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放入培养箱,细菌培养在37℃下24h,酵母培养在28℃下48h。然后取出测定抑菌圈的大小,对每一系列的复合剂样品重复实验3次,取平均值。1.2.4各组分质量配比对复合抗菌剂总体成分的影响按1.2.3进行实验,选取二组分生姜复合物抑菌效果最好的组分,再设计最佳二组分生姜复合抗菌剂中各组分的质量配比不同,而总质量(500mg)不变。计算各组分的取量体积,按体积取出各组分液混合并加无菌水在10mL比色管中定容,使各组总浓度相同,其质量配比见表4,然后进行抑菌试验,比较抑菌效果,找出二组分生姜复合抗菌剂的最佳配比。1.2.5总酚含量的测定按表4测定各组复合剂对供试菌的抑菌效果即抑菌圈直径(mm),同时分别按复合剂中生姜提取物用量及总体积定容的溶液测定多酚含量,得到复合物中总酚含量与抑菌效果的关系见图2。多酚标准曲线回归方程的方法采用Folin-酚分光光度法,以没食子酸为标准,得到C与吸光度A的关系曲线的回归方程是C=1.112042+62.005430A,相关系数R=0.99816,总酚含量以没食子酸量计(mg/mL),求得后再换算为mg/L。1.2.6复合剂抑菌试验将最佳组成和最佳配比的二组分生姜复合抗菌剂进行热稳定性实验。取部分溶液分别置于5支10mL试管中,再分别置于40,60,80,100℃水浴和121℃湿热条件下,热处理15min后(对照样为未加热溶液),以大肠杆菌为指示菌,分别用上述热处理过的复合剂进行抑菌试验,比较抑菌效果,见表5。1.2.7总浓度2.5%将最佳配比的二组分生姜复合抗菌剂(最大总浓度50mg/mL),稀释成一系列总浓度为2,5,8,10,15,20,25,30,35,40,45mg/mL的溶液。将这一系列溶液分别标号为①②③…,并按1.2.3.3进行抑菌实验操作,比较抑菌效果,得到其最小抑菌浓度。2结果与讨论2.1姜提取物中化学成分的初步测定结果2.1.1酚类物质,总酚、总酚类物质从表2可知,主原料生姜提取液中含有酚类物质,酚类物质含有酚羟基,具有还原性,易被氧化剂溴水、高锰酸钾溶液氧化;酚类物质与三氯化铁溶液的显色反应多认为是发生络合反应。2.1.2乙醇溶液的吸收光谱按1.2.2.2实验,得到主原料生姜提取物乙醇溶液的吸收光谱见图1。由图1可知:生姜提取物乙醇溶液的吸收光谱在240～400nm间出现了2个吸收峰,其中在280nm的吸收峰为苯环的特征吸收峰,也是姜酚的特征吸收峰,这与文献报道的结果一致。2.2不同浓度的生姜提取液抗菌剂对抑菌圈直径大小的影响,见表1分别按照1.2.3的操作方法及表1的方案所列的生姜复合抗菌剂对供试菌进行抑菌实验,结果见表3。抑菌圈直径越大说明生姜复合抗菌剂抑制细菌生长的作用越强,通过对表3中抑菌圈直径大小的比较可以看出:二组分生姜复合抗菌剂比单组分生姜提取液样品(10)的抑菌作用强;二组分生姜复合抗菌剂中抑菌圈最大的是样品(4)、(5)、(6),即生姜提取物和柠檬酸组合的二组分生姜复合抗菌剂的抑菌作用最强;同时二组分生姜复合抗菌剂大多比单组分的抑菌作用强,这说明生姜提取物和柠檬酸按一定比例混合使用对金黄色葡萄球菌、啤酒酵母的抑菌活性均有明显的增效作用。2.3组分生姜复合抗菌剂的最佳配比按照1.2.3及1.2.4的操作方法进行实验得到的结果见表4。由表4可知:对金黄色葡萄球菌和啤酒酵母抑菌效果最好的是样品9,抑菌圈直径最大,从而得到二组分生姜复合抗菌剂的最佳配比是生姜的质量与柠檬酸的质量之比为1.22∶1。2.4总酚及抑菌圈直径按1.2.5进行实验,得到样品1,2,3,4,5,6,7,8,9,10的复合物中总酚含量与抑菌效果的关系见图2,图中总酚含量均以mg/L计,抑菌圈直径均以mm计。由图2可知:二组分生姜复合物(生姜提取物+柠檬酸)中总酚含量与对供试菌的抑菌效果没有明显的相关性,因为在该二组分复合物中,天然总酚仅来自主组分生姜提取物,而与柠檬酸的含量无关,且生姜提取物的化学成分相当复杂,因此该二组分复合物对大肠杆菌的抑菌作用是生姜提取物中多种化学成分与柠檬酸协同效应共同作用的结果。2.5组分生姜混合物添加量的实验结果将最佳组成(生姜提取物+柠檬酸)和最佳配比(生姜的质量与柠檬酸的质量之比为1.22∶1)的二组分生姜复合物按1.2.6的实验方法操作,得到的结果见表5。由表5可知:生姜复合抗菌剂经热处理后,仍具有很强的抑菌能力,与未经高温处理的样品对比,两者实验结果无明显变化,说明高温处理对生姜复合物的抑菌作用的影响不明显,为此可将生姜复合抗菌剂加入到食品中与食品处理并用,提高加工食品的保存性。2.6对细菌和啤酒酵母的抑菌效果将最佳组成(生姜+柠檬酸)和最佳配比(样品9)的二组分生姜复合抗菌剂稀释成不同总浓度的系列溶液并按1.2.7进行实验,得到金黄色葡萄球菌、啤酒酵母的最小抑菌浓度分别为15,8mg/mL,表明复合物对金黄色葡萄球菌和啤酒酵母的抑菌效果好。3组分生姜复合抗菌剂的抑菌效果生姜提取物经显色反应和紫外可见吸收光谱的测定,初步判断其中含有酚类化合物。以生姜提取物为主要原料与茶叶提取物、柠檬酸、抗坏血酸等原料组合为二组分的生姜复合抗菌剂,测定对供试菌的抑菌活性,其结果是:当总浓度相同时,二组分复合物大多比单组分生姜提取物的抑菌效果好;二组分生姜复合抗菌剂中其组成以生姜提取物+柠檬酸的抑菌作用最强,最佳质量配比为∶生姜提取物∶柠檬酸为1.22∶1;该