利用酵母代谢途径选育双乙酰和高级醇的研究

利用酵母代谢途径选育双乙酰和高级醇的研究

高级醇是啤酒风格的重要组成部分之一。适宜的高级醇含量及相互间的比例，可使酒体丰满圆润、口感柔和协调。但高级醇含量过高，除饮时会觉有异杂味外，尚会产生较强的致醉性（即饮后头痛、头晕、发坠，俗称“上头”）。优质啤酒高级醇含量一般控制在50mg/L～90mg/L。生产上为了降低啤酒中高级醇的含量已采取了种种措施，如采用低温发酵、增加接种量、严格控制麦汁中氧的含量等等。但最根本的措施是采用低高级醇产量的啤酒酵母菌种进行发酵。双乙酰含量则是啤酒主要的成熟指标。生产上为了加快双乙酰的还原，往往采用提高发酵温度、加压发酵的方法，但发酵温度的提高又可能导致高级醇含量的增加，因此往往不能两全。在啤酒酵母育种上，降低双乙酰含量的育种报道较多，但降低高级醇产量啤酒酵母的育种报道非常少，仅有一些有关其育种思路的报道。原因可能在于：其一，高级醇的种类较多（30多种以上），某一种高级醇含量降低时，其他的高级醇含量有可能升高；其二，高级醇的代谢途径有2条，影响的因素相对较多；其三，由于高级醇是酵母细胞生长代谢的副产物，酵母生长越快（发酵越快），高级醇含量往往越高，这在生产上往往是一对矛盾；其四，育种思路设计不尽合理，对啤酒的品质产生了负面影响（如双乙酰还原变慢等）。现有的降低高级醇含量的酵母菌种选育思路，是通过选育支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）营养缺陷型突变菌株来实现啤酒高级醇含量的降低。但营养缺陷型菌株用于生产是有缺陷的。而将降低高级醇和双乙酰含量两者结合起来的育种更是未见报道。作者根据酵母相关的代谢途径设计了一套育种思路，利用紫外（UV）诱变,乳酸平板、麦芽汁-碳酸钙平板、TTC上层平板显色，分离得到了1株高级醇产量降低约30%，双乙酰亦较低的新菌株。现报道如下，以供同行参考。1材料和方法1.1病毒啤酒酵母（Saccharomyescerevisiae)YZD：由扬州大学食品科学与工程学院食品科学系保藏。1.2培养基的制备麦芽汁培养基：青啤集团扬州公司提供麦芽汁，稀释至8°P～10°P,pH自然，固体麦芽汁培养基加2%琼脂。0.1MPa灭菌20min。酵母完全培养基（CM）:2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖，pH6.0，加2%琼脂即成固体培养基。0.1MPa灭菌30min。乳酸培养基：4%乳酸，0.5%硫酸铵，0.1%磷酸二氢钾，0.01%氯化钠，0.05%硫酸镁，0.01%氯化钙，0.02%酵母膏，调pH6.0。加2%琼脂即成固体培养基。麦芽汁-碳酸钙培养基：麦芽汁琼脂培养基中加0.15%碳酸钙。碳酸钙干热灭菌后加入。TTC上层培养基：TTC0.05g，乳酸0.5g,pH6.0，琼脂1.5g，蒸馏水100mL。发酵培养基：12°P麦芽汁，α-AN约161mg/L～180mg/L,pH自然。0.09MPa灭菌20min。1.3实验方法1.3.1蘑菇的激活将啤酒酵母菌种接种于麦芽汁斜面培养基上，25℃培养36h～48h，进行活化。1.3.2酵母菌体的培养将活化好的酵母菌接种1环于20mL酵母液体完全培养基中，20℃，120r/min振荡过夜。取0.1mL接入另一20mL酵母液体完全培养基中，20℃，120r/min振荡培养至A600约为0.7（以空白培养基作参照）。以4000r/min离心10min收集酵母菌体，并以适量无菌生理盐水洗涤2次。将酵母菌体悬浮于10mL无菌生理盐水中，并以无菌生理盐水进行10倍系列逐级稀释，以血球计数板对各稀释样计数。1.3.3紫外诱变处理吸取10mL酵母菌悬液（浓度约为106个/mL）于90mm无菌培养皿中进行紫外诱变处理。诱变参数为：15W紫外灯，照射距离25cm，时间为10s、20s、30s、40s、50s、60s、120s、180s不等。用平板菌落计数计算致死率。1.3.4培养麦芽汁-碳酸钙体系将诱变处理过的酵母细胞均匀涂布于乳酸固体培养基上，置于暗处25℃培养3d～5d，挑选生长菌落较大、菌层较厚的菌株约40～50株转接于麦芽汁-碳酸钙培养基上，25℃培养3d后菌落影印到乳酸培养基上，25℃培养3d，待菌落长成，加入TTC上层培养基于暗处培养2h～3h。挑选麦芽汁-碳酸钙培养基上菌落大小、溶钙圈均较适中，乳酸培养基上红色相对较深的菌株进行进一步鉴定。1.3.5高级醇和乳酸含量测定将选出的菌株进行发酵试验，每株1瓶，发酵培养基10℃～12℃培养5d～6d后分别测定高级醇和乳酸的含量。选择高级醇较低、乳酸含量较高的菌株进行发酵性能测定。1.3.6选择蘑菇的发酵性能测定复筛菌株发酵培养基主酵为10℃～12℃培养6d，后酵8℃培养18d～25d后测定相关指标的含量。以原出发菌株做平行试验。1.4发酵指标的测定发酵液中高级醇含量的检测：见文献；发酵液中酒精度测定：见文献；酵液中双乙酰含量的测定：见文献；最终发酵度的测定：见文献；发酵液中乳酸含量的测定：见文献；啤酒酵母乳酸脱氢酶粗酶活力的测定：见文献。2结果2.1紫外诱导效果2.1.1诱变时间及致死率以不同时间的致死率绘制致死率曲线如图1。由图1可知，在诱变时间为45s时，致死率曲线出现拐点（约为99.9%），在120s以上时，致死率为100%。以诱变时间为45s时的剂量对出发菌株进行紫外诱变。2.1.2培养基上的菌株组合诱变后菌株在乳酸培养基上的生长情况如图2。由图2可知，诱变处理后菌株在乳酸培养基上生长大小并不均一，其中有少数菌落生长较大。而目标菌株应该在这些菌落生长较大的菌株中。选择菌落生长较大的菌株接种到麦芽汁-碳酸钙培养基上。初筛菌株在麦芽汁-碳酸钙培养基上的生长情况，见图3。由图3可看出，菌株生长形成菌落的大小及溶钙圈并不一致。显然菌落很小，溶钙圈也很小的菌株肯定不是目标菌株，选择菌落大小、溶钙圈均适中的菌株影印到乳酸培养基上。初筛菌株在乳酸培养基上TTC显色后的情况，如图4。由图4可知，诱变菌株红色深浅不同。选择红色相对稍深的菌株，并对照图3挑选合适的菌株进行复筛。2.2发酵结果分析选出约25株菌株进行发酵试验，同时以原菌株在相同条件下发酵作为对照。其中部分试验结果见表1。由表1可知，经初筛得到的诱变菌株大部分菌株（除Y0404外）发酵高级醇含量较原菌株都有不同程度的下降，同比乳酸含量有所提高。2.3y115、y1110菌株测定对Y0401、Y0402、Y0403、Y0705、Y1105、Y1110等菌株测定结果见表2。由表2可知，菌株Y1110发酵高级醇和双乙酰含量最低，而外观发酵度和实际发酵度与原菌株无明显差异，因而较为理想。2.4选择对蘑菇发酵性能的初步测定将菌株Y1110和原出发菌株进行发酵试验，从啤酒主酵期第2天起，分别取样测定发酵过程中相关指标。2.4.1双乙醇和高脂醇含量的变化见图5由图5可知，菌株Y1110在发酵过程中，高级醇和双乙酰含量都有不同程度的降低，与育种设计预想的菌株性能是一致的。2.4.2ldh比活力及乳酸浓度由图6可知，在啤酒发酵过程中，酵母LDH比活力呈现前期增加，中后期迅速降低的态势。大约在发酵第4天时达到最大值，后酵结束时LDH比活力降至最低。与原菌株相比，诱变菌株LDH的比活力在前期上升非常之快，第4天时约为原菌株的4倍；在中后期，诱变菌株LDH比活力下降亦较快，至发酵结束时，LDH比活力与原菌株大体持平（略高于原菌株）。发酵液中乳酸浓度的变化，则与LDH比活力的变化有着惊人的相似：LDH比活力较高时，乳酸浓度亦相应较高，LDH比活力下降时，乳酸浓度亦相应下降，但发酵结束时乳酸浓度比发酵开始时略有增加。这可能是由于酵母细胞内催化正向反应（生成丙酮酸）的速率，远远低于催化逆向反应的速率（生成乳酸），使得生成的乳酸不被很快地消耗掉。由于诱变菌株LDH比活力较大，相应代谢乳酸的能力也较大。不难看出，虽然诱变菌株LDH比活力较大，但对发酵终了乳酸浓度的影响却不大。由此可知，发酵过程中乳酸和乳酸脱氢酶活力的变化与预期的基本一致。2.4.3发酵结束时的正常物理测量见表3由表3可知，与原菌株相比，由诱变菌株（Y1110）发酵生产的啤酒，其高级醇和双乙酰含量均明显降低，而其它理化指标与原菌株相似。2.5发酵性能测定结果将菌株Y1110在麦芽汁斜面培养基上连续接种5～7代，进行发酵性能测定，测定最终发酵液中高级醇、双乙酰、最终发酵度，结果见表4。从表4可知，传代后与传代前菌株主要性能类似，故遗传稳定性较好。3讨论3.1教育理念的设计育种思路是根据啤酒酵母相关的代谢途径及其相互间的关系设计的。3.1.1高级醇的合成途径现有研究成果表明，酵母代谢高级醇的途径有2条，即合成途径和分解途径。合成途径（harris途径）：是由葡萄糖经EMP途径和TCA循环及其它的中间产物合成氨基酸的途径中形成中间体α-酮酸，进一步还原形成相应的高级醇，过程表示见图7。由图7可知，要降低高级醇的生成量，则必须降低各相关中间物质如丙酮酸、高级酮酸等的积累浓度。并且，NADH浓度的下降，也能降低高级醇的生成量。分解途径（Ehrlich代谢途径）：即由氨基酸分解代谢产生高级醇，过程表示见图8。由图8可知，要降低高级醇的生成量，同样必须降低相关中间产物的积累量。即要降低转氨酶等酶的活力。但在harris途径中增加转氨酶的活力有利于降低高级醇的合成。因此，这就要求酵母在发酵初期，麦汁中氨基酸的含量丰富时，转氨酶被较多地抑制，而在发酵中后期时，转氨酶又能被较多的诱导。2种途径合成高级醇的比例，可能是由于合成代谢途径的中间体丙酮酸较易转变为低分子的α-酮酸，大部分低碳链高级醇是通过合成代谢途径产生的。Growell等于1961年指出，高级醇中的异戊醇、异丁醇和活性戊醇，75%是由糖形成的。3.1.2硫酸代谢途径酵母的乳酸代谢途径见图9。由图9可知，在酵母细胞内，酵母乳酸脱氢酶催化生成乳酸的反应要比其逆向反应快。3.1.3高级醇的产生原因及影响其生成量的因素，即高级醇和乳酸的生成都需要消耗NADH。在酵母细胞中，细胞质核酸池内NADH和NAD的总量是一定的。乳酸代谢能力的增加（合成），必然消耗更多的NADH，如果同一时间内NADH的合成并不增加的话，则其它途径消耗的NADH必然减小。也就是说用于还原酮酸的NADH必然相应减少，因而产生的高级醇也必然会降低。从另一方面讲，假定酵母糖代谢的能力不变，则乳酸代谢能力的增加（合成），必然会降低丙酮酸的浓度，也就是说有更少的糖用于细胞的合成，细胞生长速度必然降低，而高级醇正是细胞生长的副产物，因而其生成量必然降低。由于乳酸脱氢酶是双向酶，当发酵液中糖分降低到一定程度时，酵母细胞又会吸收一部分乳酸用于代谢需要（还原双乙酰），此时一般处于后酵阶段，温度较主酵低，不会引起酵母细胞的合成，故高级醇的含量不会有较多的增加。总之，理论上分析，高级醇的生成与乳酸代谢途径应该是反向的关系。3.1.4双乙酰还原酶系统由图10可知，α-乙酰乳酸是缬氨酸和高级醇合成途径的前体物，因而可认为双乙酰和乙偶姻是酵母合成氨基酸和高级醇过程的副产物。丙酮酸浓度的降低必然导致α-乙酰乳酸合成的减少，相应双乙酰的含量也会降低。将双乙酰还原成乙偶姻和丁二醇的酶主要是酵母的醇脱氢酶（ADH）和乳酸脱氢酶（LDH）。只要2种酶中有一种酶的活性提高（另一种酶不变），那么双乙酰的还原必将加快。但醇脱氢酶活力提高会提高高级醇产量。3.1.5降低高级醇、双乙酰合成不难看出，提高酵母乳酸脱氢酶的活性，可以相对降低酵母细胞内丙酮酸和NADH的积累浓度，从而降低高级醇、双乙酰的合成，加速双乙酰的还原，并且使酵母在不过分旺盛地生长；诱导和抑制转氨酶能力较高的酵母，也有利于降低高级醇的生成。同时必须考虑酵母其他发酵性能不能丧失。3.2诱变剂量的选择紫外诱变由于其操作方便，效果良好，一直是育种工作中普遍采用的方法。诱变剂量的选择，则结合了本实验室以前的经验，采用99%的致死剂量。从致死率曲线上看，取拐点处的诱变时间，即40s。3.3选择二级库的选择3.3.1酵母生长和芽孢杆菌生长速度的影响诱变后，如果酵母乳酸脱氢酶活性提高的话（假定没有其它突变发生），那么酵母细胞在以乳酸为惟一碳源的培养基上的生长速度必然会加快，并且如果酵母诱导转氨酶的能力也同时提高，则酵母生长的菌落也必然较大。另一方面，乳酸基础培养基可以避免营养缺陷型酵母造成的干扰，使得所筛选出来的菌株在营养型上属于野生型，如果能用于生产的话，则必定生长相对较为强势。但乳酸基础培养基不可能将突变发生在EMP途径上的菌株区别出来。3.3.2生物活性炭培养基“无酸不成酒”，产酸性能是啤酒酵母的一项重要性能。诱变后酵母细胞不能丧失这一性能，因此通过平板上溶钙圈的大小即可进行判别。同时转氨酶抑制较强的酵母在麦汁培养基上生长一般并不特别显著。另外通过此培养基也可将EMP途径上发生突变的菌株也能鉴别出来（菌株生长较慢、菌落较小、一般溶钙圈很小）。3.3.3酵母醇脱氢酶活力的测定TTC是（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）一种人工受氢体，