固相析出分离技术-盐析法

沉淀法介绍盐析概念一盐析的原理二目录一二盐析的操作步骤三盐析的注意事项四由于不同的蛋白质溶解度.不同，沉淀时所需的离子强度也不相同,如果需要先除去些杂蛋白,然后在较高的饱和度下,沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白。一、分段盐析二、盐析用盐量的确定--饱和度◆饱和度的概念:以硫酸铵为例:25°C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。◆目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。◆对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于0.1mg/L,通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%--60%之间。1.分段盐析的条件先需要进行小实验探索，如：先进行0%-30%的硫酸铵沉淀，再进行30%-60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%-80%的硫酸铵沉淀。2.每一段盐析静置之后都将离心取沉淀，透析并检测活性。通过实验结果可以看出哪一段盐析出来的目的产物最多，相对来说杂质就更少。3.比如实验中的活性物质主要在60%-80%这段出来，在以后的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物可以抛弃（去处大多数杂质）；然后进行60%-80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀出来是物质是所需要的目的物质含量比较高的物质，将其收集进行下一步纯化工作。三、分段盐析操作步骤(1)加固体硫酸铵时，必须注意表中的温度。(2)分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的变化。(3)盐析条件如pH、温度和硫酸铵的纯度都必须严格控制。(4)盐析后-般要放置0.5~1h。(5)盐析过程中，搅拌必须规则和温和。(6)反应至少应在50mmol/L缓冲溶液中进行。四、操作注意事项盐析法盐析概念一盐析的原理二目录一二盐析的注意事项三一、盐析概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质(酶)等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的。而变性是不可逆的。早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增高而上升(盐溶)但当盐溶度增加到一定数值时，其溶解度有随盐浓度逐渐下降，直至蛋白，质析出(盐析)。盐析的内因是当盐浓度达到--定程度时，水的活度降低，导致蛋白质分子表面电荷中和，水化膜相继破坏，蛋白质分子聚集而析出沉淀。二、盐析的原理常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用。因为硫酸铵具有:①离子强度大，盐析能力强②溶解度大且受温度的影响小③不易使蛋白质变性④价格价廉三、盐析常用盐1.要有较强的盐析效果2.要有足够大的溶解度，且溶解度受温的影响效果小3.不影响蛋白质等生物大分子的活性4.来源丰富，价格低廉四、盐析所用无机盐的选择原则盐饱和度的影响:不同的蛋白质，其结构和性质不同，盐析时所需的饱和度也就不同。蛋白质浓度的影响:--般常将蛋白质浓度控制在2-3%为宜。pH的影响:进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pl附近。温度的影响:蛋白质的盐析一般在室温下进行。五、盐析影响因素(1)加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况;工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；(2)加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况;它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释；(3)透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱