原生质体融合技术在菌种选育中的应用

原生质体融合技术在菌种选育中的应用

20世纪60年代，原生质体一体化是一项发展起来的遗传重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象,同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合,从而开始了细胞融合的探索。1974年匈牙利的Fereczy采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creotrichumcandidum)营养缺陷型突变株原生质体的融合;随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合率比较低;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题,使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量的报告,从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。从此,原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌,并从株内、株间发展到种内、种间,打破种属间亲缘关系,实现属间、门间,甚至跨界融合。1原生质体融合的特点原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁,释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体,然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。原生质体融合与常规杂交相比有多方面的优势,除了能显著提高重组频率外,还具有定向育种的含义。此项技术能把亲缘关系比较远,甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起,为远缘杂交架起了桥梁,是改造细胞遗传物质的有力手段,它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界限,更重要的是扩大了遗传物质的重组范围。微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生。2原生质和体融合技术的详细介绍2.1原生质体的形成酶微生物细胞一般是有细胞壁的,进行该项技术的第一步就是制备原生质体。当前去除细胞壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于某些特定菌株,因此,并未得到推广。在实际工作中,最有效和最常用的是酶法。该法时间短,效果好。使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长期或生长中后期的菌,也有的采用生长后期的,这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智华等对野生大杯蕈(Clitocybemaxima)进行原生质体制备的过程中,用2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌等证明,在一定范围内,酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。林红雨等采用酶解10min后补加EDTA的方法,改变酶解环境中的离子强度和渗透压,可以提高原生质体形成率。CosteronJ.W.等(1967)报道,在高渗Tris溶液中添加115%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生质体扩张剂,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。2.2人为融合由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,所以在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为地促融合。当前常用的方法主要有:化学法、物理法和生物法等。这几种方法各有其自身的特点,在进行实际工作中可根据操作对象选择适合的融合方法。2.3种子质体的筛选假设用于原生质体融合实验两亲本的基因型分别为A和B型,那么经诱导融合,整个群体中含有五种类型:A,AA,AB,BB,B。其中只有AB型才有可能形成真正的杂种细胞,而其余四种类型必须淘汰。所以考虑采用一种行之有效的筛选方法是原生质体融合实验里至关紧要的一环。下面介绍几种常用的筛选方法。2.3.1培养基的选择即融合的双亲为营养缺陷型,并且为不同的缺陷型。双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子,缺陷的单亲原生质体由于丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能萌发生长,单亲融合的原生质体也不能长出菌落,双亲原生质体融合后,缺陷的遗传物质得到互补可以恢复为野生型,在基本培养基上能够萌发生长成为菌落。2.3.2基于细菌特性的融合子法微生物的抗药性是其菌种的特性,是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异或与菌种其它特性结合起来即可对融合子进行选择。这种方法首先由Bradshaw和Peberdy于1984年使用。药物的浓度过高会使融合频率降低,浓度过低则会使亲本生长,影响融合子的检出。2.3.3原生质体融合子的选择原生质体经紫外线照射、加热或经某些化学药剂的处理,可使其丧失在再生培养基上再生的能力,而只能作为遗传物质的供体。从而只根据另一亲株特性设计选择条件而选择融合子。周东坡等通过紫外线照射灭活原生质体融合选育了啤酒酵母新菌株。用0.1%碘乙酸,30℃处理产阮假丝酵母(Candidautilis)原生质体40min后,与啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的原生质体融合,利用形态差异选择融合子。灭活原生质体的机理认为是:紫外线使菌株的DNA发生突变,热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶蛋白变性失活,化学药剂的作用能不可逆地抑制细胞代谢过程的关键酶,使之失活。3原生质体融合技术3.1选育优良的菌种原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。彭帮柱等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为亲本,通过原生质体融合,得到融合子8#菌株,具有产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。黎永学等以双歧杆菌和酿酒酵母为亲本进行融合,得到的融合子具有双亲的生物学特性,为双歧杆菌生物学功能的开发提供了新思路、新途径。王宪等利用原生质体融合技术获得具有双亲杀虫谱的新菌株。诸如此类的报道国内外均有。3.2选育抗菌素高产菌株在抗生素的研究中,原生质体融合技术可用于提高抗生素的产量。但是,种间融合获得的融合子菌株往往会产生一些不希望有的组分。为了解决这一问题,张瑾阳等在进行去甲基金霉素产生菌与金霉素产生菌原生质体融合以选育产去甲基金霉素的菌株时,对金霉素产生菌的原生质体进行热灭活,减少了既产生金霉素和四环素又产生去甲基产物的融合子。结果在所得的融合子中85%以上只产生去甲基产物,从而提高了目的产物的相对产量。3.3改良菌种的遗传特性通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组,从而获得兼具两个亲本优良性状的新菌株。如苏云金杆菌以色列变种(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis)产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫,而苏云金杆菌库斯塔基变种(Bacillusthuringi-ensissubsp.kurstakiHD-I)产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将这两个菌株的原生质体进行融合,筛选得到既杀鳞翅目昆虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。3.4原生质体融合技术在污水工程菌构建上的应用利用微生物处理及利用污水是一个很有效的方法,但是这一技术的应用往往涉及多种微生物,多种菌的优化组合是一个很复杂的课题,原生质体融合技术可以将多个功能组合到一个菌上,为其在污水处理上的应用提供了良好的条件。许燕滨等采用原生质体融合技术,将两株具有含氯有机化合物降解特性的菌假单胞菌T-1和诺卡氏菌RB-1融合构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌,应用于造纸漂白废水,融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高了72.05%和190%。周德明采用原生原体融合技术将球形红假单胞菌和酿酒酵母构建成高效降解工程菌,工程菌用于废水处理的比降解率明显提高。程树培等将光合细菌与酵母菌进行原生质体融合,用于连续发酵豆制品废水处理。程树培等由单亲株灭活法获得的酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂种酵母细胞,在净化味精废水产生单细胞蛋白方面优于双亲菌株,为提高废水的净化效率,增加单细胞蛋白的产量,创造了极为有利的条件。4原生质体融合技术在微生物育种中的应