蓝莓酒发酵复合酶的筛选与应用

蓝莓酒发酵复合酶的筛选与应用

0蓝莓酒是最主要特色的水果蓝莓是蔷薇科植物的学名，属于蔷薇科和蓝莓科。蓝莓果为小浆果,果实呈蓝色,近圆形,果肉细腻,种子极小。甜酸适度,且具有香爽宜人的香气,可鲜食,也可作为食品、饮料、医药等行业的原料。蓝莓单果重0.5~2.5g,最大可达3.5~5.0g,对从美国引进的14个品种的蓝莓果实分析,每百克蓝莓鲜果中含蛋白质400~700mg、脂肪500~600mg、碳水化合物12.3~15.3mg、维生素A高达81~100国际单位、维生素E2.7~9.5μg、SOD5.39国际单位,维生素都高于其他水果。微量元素也很高,每克鲜果中钙220~920μg,磷98~274μg,镁114~249μg,锌2.1~4.3μg,铁7.6~30.0μg,锗0.8~1.2μg,铜2.0~3.2μg。蓝莓果实中富含水果中常见的多种营养成分,以及花色素苷、类黄酮等抗氧化剂和细菌生长抑制剂,属高氨基酸、高锌、高铁、高铜、高维生素的果品,具有良好的营养保健作用,包括增强视力、消除眼睛疲劳、防止脑神经老化、抗癌、软化血管、增强人体免疫等。其营养价值远高于苹果、葡萄、橘子等水果,堪称“世界水果之王”,是近几年世界发展最为迅速的集营养与保健于一身的第三代浆果,风靡当今欧美日等国家和地区。蓝莓果实不仅营养价值高,含有大量对人类健康有益的物质,包括抗氧化物(VA、VC、VE),靴酸、抗菌成分和丰富的食用纤维等。国际上鲜果的零售价很高,美国最低零售价在3美元/磅左右,日本高达40~50美元/kg。鲜食蓝莓通常以125g为单位包装销售,采收后的包装、储藏、运输、上市和货架过程均需在0℃左右条件下进行,保鲜期约3个月。我国生产的蓝莓鲜果的出口价在5美元/kg以上,未能及时作为鲜果销售的蓝莓和残次果,可以加工果汁和酿造营养丰富的蓝莓酒等。我国发展蓝莓产业潜力巨大,在黑龙江的伊春地区,加格达奇地区,大兴安岭地区,都盛产野生蓝莓。近几年我国种植发展较快,在贵州、江苏、吉林、辽宁都有大面积种植,蓝莓果国内年产量可以达到5000吨以上,仅丹东市蓝莓种植面积已达近万亩。为我们开发蓝莓产品的深加工提供了原料保证。近几年来,我们从复合生物酶制剂,分离,筛选,鉴定酵母菌开始,作了大量的试验工作,研究酿造蓝莓酒的最佳工艺条件,取得了突破性进展。本文重点介绍组合酶法快速酿造蓝莓酒新工艺的生产方法,现将试验结果报告如下:1材料和方法1.1材料表面1.1.1酶剂1.1.2蓝莓果实：由辽宁省龙鑫蓝莓饮料有限公司提供1.1.3母菌种类从不同品种蓝莓果和黑加仑子果的果实,以及不同地区蓝莓果和黑加仑子果的果园中筛选、分离、纯化、鉴定得到。1.2测试方法1.2.1组合酶正交试验根据生物酶法酿造黑莓酒的研究,分解蓝莓果的生物酶我们初步确定了使用果胶酶,纤维素酶和半纤维素酶三种酶,用正交表L9(34)设计组合酶含量及组合酶用量,作为四因素,每个因素三个水平进行正交试验。用上述4因素,3水平正交表设计分解蓝莓最佳酶制剂组合的验方案如下:1.2.2通过分离和测定细菌性能1.2.2.麦芽汁常用菌落的分离和纯化从不同品种的蓝莓果和黑加仑子果实,以及不同地区的蓝莓果和黑加仑子果园土,用12°BX麦芽汁培养基进行菌种分离。麦芽汁pH3.8或加有少量链霉素。于27℃培养48h后,用稀释法分离,或培养3天至1周后,直接于麦芽汁平皿上划线分离,挑取不同类型的菌落,纯化。所分离菌种株与中国科学院微生物研究所的葡萄酒酵母AS2.374、AS2.612以及生香酵母AS2.300、AS2.470、AS2.1182等进行对比测试。1.2.2.2.防疫性能1.2.2.2.1固酒性能将需测试的酵母细胞接入12°Bx的麦芽汁液体培养基中,27℃下培养96h后,经蒸馏,用酒精比重计测酒精含量,比较其产酒力。1.2.2.耐二氧化碳能力的测定将需测试的酵母细胞接入分别含不同二氧化硫浓度培养基(含二氧化硫1.5~4kg/万升溶液)的杜氏发酵管中,在27℃下培养48h,观察其发酵情况,判断其耐二氧化硫的能力。1.2.2.耐酒精能力的确定将需测试的酵母细胞接入分别含不同酒精浓度的麦芽汁培养基(含酒精12%vol~20%vol)的杜氏发酵管中,在27℃下培养48h至一周,根据发酵力,确定其耐酒精的能力。1.2.2.耐酸性能测定将需测试的酵母细胞接种于分别含不同浓度柠檬酸的麦芽汁培养基(含1~3.4g/100mL)杜氏发酵管中,在27℃下培养48h至一周,根据发酵力判断菌株的耐酸性能。1.2.2.2.5产品范围将需测试的酵母细胞接入含5%葡萄糖的12°BX麦芽汁培养基中,经96h发酵后,用日本产GC-5A气相色谱仪分析有关酯类。1.2.3生产工艺条件试验1.2.3.蓝莓汁、蓝莓汁和制备工艺的制备根据我们多年从事水果酒酿造的实际经验,确定蓝莓酒发酵工艺和浸制工艺试验方案如下:1.2.3.1.1蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→组合酶酶解→灭酶→冷却→分离→蓝莓清汁→果浆成份调整→接酿酒1号酵母发酵→过滤→澄清处理→酯化→调配→过滤→包装→成品1.2.3.1.2蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→果浆成份调整→接酿酒1号酵母发酵→陈酿→澄清处理→调配→过滤→包装→成品1.2.3.1.3蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→加热处理→冷却→果浆成份调整→接酿酒1号酵母发酵→酯化→陈酿→调配→过滤→包装→成品1.2.3.1.4蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→组合酶酶解→灭酶→冷却→分离→蓝莓清汁→脱臭酒精浸制→浸制原酒→酯化→调配→过滤→包装→成品1.2.3.1.5蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→脱臭酒精浸制→浸制原酒→陈酿→调配→过滤→包装→成品1.2.3.1.6蓝莓→分选→破碎→蓝莓果浆→加热处理→冷却→脱臭酒精浸制→浸制原酒→调配→过滤→包装→成品2结果与讨论2.1蓝莓生物酶添加量的确定通过9种试验,其组合酶的重量份确定为:果胶酶90%、纤维素酶5%、半纤维素酶5%、组合生物酶分解蓝莓果的最佳用量为5/万。酶解最佳温度为45~50℃。2.2酵母菌的分离经过对100多份黑加仑子与100多份黑加仑土壤及车间蓝莓和黑加仑自然发酵液的分离,共分离得到185株酵母菌。在初步测试发酵力的基础上,选择了一株产酒较高的菌株(编号为酿酒1号),将酿酒1号菌与其他产酒与产酯酵母对比,结果如下:2.2.1葡萄酒酵母as26株酵母经96h发酵后,所产酒精量以酿酒1号最高,产酒达5.1%vol;另二株葡萄酒酵母较低,其中AS2.1182为4.5%vol,AS2.374为3.7%vol。其他产酯酵母如AS2.300、AS2.470、AS2.1182虽能生香但产酒力很低,只达1.5%vol~2.0%vol,结果见表3。2.2.2发酵时间对so2发酵的影响6株酵母在含0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.04%的不同浓度SO2的培养基中,经48h及一周发酵后,酿酒1号的耐SO2能力最高,在SO2浓度为0.04%时仍正常发酵,而AS2.374最差。其他几株产酯酵母中以AS2.470、与AS2.300的耐SO2的能力较强,其他则较差(表4)。2.2.3酒精培养基的发酵6株酵母在含12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol的酒精培养基中,经48、96h发酵后,酿酒1号的耐酒精力最强。经48h培养后,在含18%酒精的培养基中仍发酵较好。经96h培养后在含20%酒精培养基中发酵也良好,而其他菌株则较差,结果见表5。2.2.4不同柠檬酸添加量的发酵6株酵母在含1%、1.8%、2.6%、3.4%(质量体积分数)的不同浓度柠檬酸的培养基中,经72h及1周培养后,发现酿酒1号耐酸力最强。在含柠檬酸1.8%以下时,经培养48h后,发酵很旺盛,当含柠檬酸3.4%时,培养一周后,仍能发酵。而AS2.374在含酸2.6%以上就停止发酵。在产酯酵母中则以AS2.300的耐酸力好,结果见表6。2.2.5香味阀值的确定酵母菌对乙醇饮料所赋予的香味是由于不同的化合物形成的,不同化合物有不同的香味阀值,一般根据嗅觉也能初步判别。经初筛认为AS2.300的发酵液香味最浓,又经过对三株酵母的发酵液所进行的气相色谱层析的比较分析,AS2.300产酯量较高,其中乙酸乙酯的量达69.9mg/100mL(表7)。2.3酒精1号发酵母菌的鉴定2.3.1培养基上细菌生长在麦芽汁培养基中,经25℃培养3d后,细胞呈短椭圆形,细胞大小为(3.1~3.6)×(6~11.5)μm,培养一月后不形成醭。在麦芽汁琼脂培养基上,25℃3d培养后细胞呈长椭圆形,多边芽殖,细胞大小为(2.7~3.2)×(5.6~11)μm,培养1月后。细菌呈奶油色,表面较光滑。在克氏(Kleyn)生孢子培养基上,能形成子囊孢子。孢子椭圆形,不太规则,大小为(2.7~3.0)×(3.0~3.4)μm,每个子囊含1~3个子囊孢子,不形成假菌丝。2.3.2其他碳源、氮源与培养基酿酒1号能发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖与棉子糖,不发酵蜜二糖、乳糖。能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、松三糖、乙醇、甘油、山梨醇、α-甲基-葡萄糖苷、乳酸、柠檬酸、不同化所测的其它碳源,如L-山梨糖、纤维二糖、乳糖、蜜二糖、菊糖、可溶性淀粉、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、L-鼠李糖、赤藓醇、阿东糖醇、卫矛醇、D-甘露醇、水杨甙、琥珀酸、柠檬酸、肌酸。在氮源方面不同化KNO3、盐酸乙胺。在无维生素培养基上不生长,在100mg/L与1000mg/L放射线双酮的培养基中不生长,不分解尿素与杨梅甙。根据上述形态与生理特征,酿酒1号定名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。2.4蓝莓酒生产和浸泡过程的确定和要点2.4.1酒发酵工艺和浸制工艺实验对比在蓝莓酒传统的发酵工艺中,相当长的时间为原酒陈酿过程,也就是原酒的澄清过程,一般经过三年以上的原酒才能达到透明、晶亮,物理性能比较稳定,酿造成的成品酒质量才能稳定,不会出现成品酒沉淀等质量问题。通过我们对蓝莓酒发酵工艺和浸制工艺六种不同条件实验的对比(见表6),方案一和方案四制得的蓝莓原酒达到了非常好的技术效果,从酿造时间看,方案四方法三个月和方案一方法六个月制造出来的原酒的澄清程度与传统工艺方案二方法三年的澄清度还要好,而且果香味突出,出汁率也提高了近10%,新工艺方法是发酵和浸制之前,首先利用组合生物酶把果汁处理清,果汁澄清后,去掉了果酶质、纤维素、多糖等物质后再进行人工酵用发酵和浸制,不仅提高了设备利用率,减少资金积压,降低了生产成本,而且酿造出来的蓝莓酒果香浓郁、绵长、清澈透明、营养丰富、口味纯正、爽口。蓝莓酒新工艺的研制成功,为红酒的生产探索出了一条新的生产途径,可用于红葡萄酒、黑加仑酒、山楂酒、黑莓酒推广应用。2.4.2蓝莓酒生产中的操作要点2.4.2.1、蓝莓评分酿造蓝莓酒用的蓝莓果,要求果农在采摘时即进行分选,分选时主要是将霉坏粒分选出来,否则经过封装与运输就容易扩大感染,对酿酒不利。2.4.2.2骨折在破碎时,应将蓝莓果肉破碎率达到98%以上,以便在酶解过程中,通过生物酶的作用,使果肉与生物酶充分接触,达到酶解效果。2.4.2.搅拌和酶解将破碎后的蓝莓果浆泵入冷热缸中有效容积的80%,迅速将蓝莓果浆加热至50℃,在加热果浆的同时,应开启搅拌器进行搅拌,然后加入0.04%组合成生物酶制剂,在酶解过程中,要在密闭,恒温,低速搅拌的容器中进行,搅拌速度不益过高,否则会降低果汁澄清度,冷热缸要有断流装置,不然果浆会随搅拌器同时转动,降低酶解效果。2.4.2.提高果汁质量酶解后的果浆应迅速加热灭酶,酶被剧烈钝化,使果浆有一个较理想的残余黏度,提高果汁质量,灭酶后,将果浆温度降至25℃左右,再转入浸制及发酵工序。2.4.2.性炭或桦活性炭脱干将食用酒精稀释至75%vol左右,用活性炭或桦木炭等进行脱臭处理,处理后的酒精微甜、纯正、无辛辣味及异味。将冷却后的生物酶解汁加入脱臭酒精制成浸泡原酒。2.4.2.发酵液发酵、发酵、过滤将灭酶冷却后的酶解汁调整酒度,添加适量的二氧化硫,然后加入20%左右旺盛的发酵液进行发酵,按最终生成15%vol计算补糖,控制发酵温度在25℃左右,发酵时每天搅拌两次,每次30min,当残糖降至0.5%以下时停止发酵,过滤,为发酵原酒。2.4.2.发酵、酯化、温度的确定为了使原酒尽快成熟、老化,产生较好酒香,可以将酒精浸泡原酒和发酵原酒分别泵入冷热缸中进行酯化,将原酒泵入冷热缸中密闭,将罐内温度升至4