小鼠繁殖性能的观察及研究报告

-.z.实验动物学设计大纲实验名称：C57BL／6小鼠繁殖性能的观察与研究课题来源：自选设计班级：04级检验本科设计人员：***设计日期：2007年5月26日指导教师：****医学院实验技术教研室2007年制一.实验设计的目的意义,实验设计的目的意义，国外研究现状，存在的问题，解决问题的思路目的与意义:通过对C57BL／6小鼠的繁殖性能的研究从而提高其受孕率，到达最正确育种的目的。国外研究现状：C57BL／6小鼠是little于1921年采用遗传学原理，以毛色基因为标记育成的近交系小鼠。CBL／6纯系小鼠性成熟早，36日龄雄性附睾精液中有运动的精子，雌鼠在37日龄即可动情排卵、受孕。雌鼠在正常情况下，每隔4～5d为一个性周期，发情后2～3h即可排卵。妊娠期为19～21d，哺育期为20～22d。雌鼠产后还可出现一次动情期，即分娩后24h排卵，此时交配可受孕，俗称“血配〞，出现边哺育边妊娠的现象。现有研究说明交配季节在各种有关生殖的实验非常重要,一般应在春秋二季节进展。因小鼠怕热畏寒，而这季节温度比拟适宜，动物的受孕率较高。假设在夏冬季实验，动物房室温应控制在(22±2)℃。研究说明温度、光照、噪音、湿度、营养等因素对小鼠性周期影响很大。当温度低于10℃时，CBL／6纯系小鼠受孕率极低，胚胎获取常失败。光照、温度、噪音、湿度、营养等因素对小鼠性周期影响很大。当噪音高于80分贝时，小鼠烦躁不安，打架撕咬，几乎没有交配现象；当空气相对湿度低于30％时，小鼠脱毛现象严重，同时可使雌鼠受孕率降低，产仔数下降,为提高其产仔成活率现目前主要有两种方法：“预接触〞和“超数排卵〞。“预接触〞：在交配前2d，将1只雄鼠放入5cm×5cm×5em的封闭栅栏筐中，把筐放在装有8只雌鼠的鼠笼。雌鼠和雄鼠这样生活2d，第3d晚放出雄鼠，雌雄交配。“超数排卵〞(superovulation)：用孕马血清促性腺激素(PMSG)，结合人绒毛膜促性腺激素(HCG)进展，中午12：00点向雌鼠腹腔注射PMSG10U，48h后再腹腔注射HCG10U，当天晚8o0点与雄鼠1：1合笼.我们通常将裸鼠的裸基因〔nu〕导入C57BL小鼠过杂交，互交，回交的方式来获得大批量的裸鼠。但由于其繁殖能力低给实验动物的研究带来了极大的困难。存在的问题：不能很好把握好小鼠性周期四个时期的特征及确认性周期的动情期,从而对实验结果的判断有一定的影响.但其繁殖率较低，给实验动物的研究带来了困难。解决问题的思路：通过产仔成活率来判断其繁殖性能,采用阴道涂片及阴道的检查的方法,判断其动情期,用来指导其动物交配观察其产仔成活的数量,应用统计学方法分析实验结果参考文献[1]郝荣耀．实验动物学．：第二军医大学，1999．93[2]管原七郎(原著)，志超等(译)．哺育动物发育工程实验方法．：大学1992．71～77．[3]袁伯俊，王治乔．新药l临床前平安性评价与实践、：军事医学科学，1997．128132[4]文书，钟欣，邱立明．低湿度对实验小鼠繁殖的影响．赣南医学院学报，2003，3：358．[5]敬方．动物实验方法学．：人民卫生，2001．174．ObservationandStudyontheProductiveCapacityofC57BL／6MouseZHANGJian，WU*ian—jin，MaLan，HUHao，QUANQing-li。(1．BiotechnologyDepartment，HuaihuaUniversity，Htmihua，418008，China)(2、MonzwlonalAntibodyTechnologyCenterofYunnanUniversity，Kunming，650091，China)Abstract：Toimprovetherateoffertilization，theproductivecapacityofC57BL／6mousewasstudiedandtheresultsshowedthatitwasimportanttocharacterizetheestmsamongse*ualcycles．Thequalityofzygotesobtainedbynatural二、实验设计方案〔实验设计目标,拟解决的主要问题,实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排〕〔一〕实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标:通过对C57BL／6小鼠的繁殖性能的研究,找出影响其受孕率上下的主要因素,从而用来指导其育种繁殖.提高产仔成活率.拟解决的关键问题:怎样把握好小鼠性周期的特征,准确确认性周期的动情期〔二〕实验设计1、实验动物设计〔遗传背景，微生物学质量，育种繁殖，饲养管理，动物模型，实验动物学技术〕1.1遗传背景:1921年Little用AbbyLathrop的小鼠株，近亲交配，育成数个近交系动物，以57号雌鼠与52号雄鼠交配为起源者标为cc，中毛色固定为巧克力色者称为CBR；毛色固定为黑色者称为cBL，其亚系有CBL／6、C7BL／6J、C57BL／6N等。C57BL／6对Graftfi白血球因子较敏感，肿瘤自发率较低约为60%，细胞免疫力随增龄较前降低，繁殖率较低1.2微生物学质量:清洁级(CLA)C57BL/6小鼠，雌雄各半1.3C57BL／6小鼠繁殖方法:近交繁殖，初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛3、雄鼠的生殖器较雌鼠大4、雌鼠乳头较雄鼠明显性成熟期:35-55日龄；实配年龄：60日龄左右；成熟时体重：20克以上发情鉴定:看雌鼠外阴和阴道口，当外阴充血肿胀、阴道口开且呈枯燥状态，可确认为动情期雌鼠。同时可作阴道涂片观察，涂片上有大量角化上皮细胞和少量有核上皮细胞，细胞分散未成团成堆，即为动情期雌鼠。配种：动情前期交配交配形式:近亲繁殖〔全同胞兄妹交配〕妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法育种代数：作为亲本的全同胞兄妹〔初始动物〕记为0代，按雌雄1：1进展交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进展交配，以此类推，直到20代以上个体选择：选择留繁殖力强，生活力强,目标形状优良的个体保种方法：修饰平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法1.4饲养管理:C57BL／6小鼠的饲养应在开放系统的动物房进展,由于光照能刺激小鼠性激素的分泌,对雌鼠性周期有一定的影响作用,因而采用12h:12h明暗光照,采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，一般所有的笼具、垫料、饲料、饮水等都得经过灭菌消毒,温度控制在20-25℃,保持鼠房空气相对湿度45%-60%,噪音<60dB,四季都应进展通风换气,饲养的时候需用专用小鼠饲料,可在粉状饲料中添加高脂牛奶,饲料中含4%-8%的粗脂肪时,C57BL／62、实验专业设计通过光照.温度.噪音.湿度.营养等因素对小鼠性周期的影响研究,采用自然交配法与超数排卵法,确定最正确的条件,提高其受孕率,增加产仔成活率.3、实验统计设计采用平均值(*)±标准差(s),两两组间比拟用t检验,各组间比拟用方差分析，利用统计学软件进展结果分析。4．实验动物方法设计：小鼠小鼠实验组〔自然交配〕对照组〔超数排卵法交配〕观察产仔数观察产仔数5．实验技术方法：5.1.C57BL／6纯系小鼠的选择:选用性成熟未交配过的小鼠进展,雌性生育年龄60-70天,体重20-25克.雄鼠生育年龄为60-70天,体重20-30克.5.2.确认小鼠性周期动情期：选择适龄雌雄小鼠，交配前查看雌鼠外阴和阴道口，当外阴充血肿胀、阴道口开且呈枯燥状态，可确认为动情期雌鼠。同时可作阴道涂片观察，涂片上有大量角化上皮细胞和少量有核上皮细胞，细胞分散未成团成堆，即为动情期雌鼠。观察阴道涂片的组织细胞学变化和阴道口的变化情况，可确定动情期的不同阶段。5.3.动物交配与受孕动物的检查：将已确定为动情期的雌鼠分成实验组和对照两组，实验组采用自然交配的方式按雌雄1：1比例晚8:o0点合笼，次日清晨做阴道涂片和阴栓的检查，对照组采用超数排卵法交配的方式，用孕马血清促性腺激素(PMSG)，结合人绒毛膜促性腺激素(HCG)进展，中午12：00点向雌鼠腹腔注射PMSG10U，48h后再腹腔注射HCG10U，当天晚8o0点与雄鼠1：1合笼.阴道涂片检查：镜检发现精子，则为阳性，记为孕期0．5d。阴栓检查：检查雌鼠阴道有无阴栓，必要时用眼科镊子插入阴道，撑开阴道口，查看有无阴栓。有阴栓者确定为受孕．记为孕期0．5d。5.4.动物交配与妊娠的识别:小鼠交配后，在雌鼠阴道口形成一种白色阴栓，外形为“Y〞字形，外表有细横纹，“叉状〞段连接阴道深部。小鼠阴栓一般在交配后12～24h自动脱落。常把阴栓的有无作为判断是否交配的重要标志.识别小鼠是否妊娠，可通过观察C，BL／6小鼠的动情周期是否消失，观察阴道粘膜的色泽、粘液性状、阴道口径变化情况等加以判断.5.5.统计：约19-21天后产下幼仔观察并统计其数量。〔三〕可行性分析：3．1此实验操作简便,实验指标易于观察.3．2小鼠易获得,易饲养〔四〕预期效果:在适宜的实验环境下，实验组的小鼠的受孕率较高，产仔率也较高〔五〕实验设计工作时间安排：实验工程工作时间安排实验小鼠的选择30min确认小鼠的动情周期20min小鼠交配与受孕检查12h小鼠的妊娠繁殖19-21d三、完成实验的条件1、仪器设备情况：棉签