医械生物学评价实验课件

医疗器械生物学评价试验介绍

山东省医疗器械产品质量检验中心生物学评价室王昕2021年10月医疗器械生物学评价相关规章国家食品药品监督管理总局2021年第43号?关于公布医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告?医疗器械生物相容性评价研究应对成品中与患者和使用者直接或间接接触的材料的生物相容性进行评价。生物相容性评价研究资料应当包括：1.生物相容性评价的依据和方法。2.产品所用材料的描述及与人体接触的性质。3.实施或豁免生物学试验的理由和论证。4.对于现有数据或试验结果的评价。医疗器械生物学评价系列标准GB/T16886.1-20局部GB/T16886.1风险管理过程中的评价与试验5GB/T16886?医疗器械生物学评价?系列标准

GB/T16886?医疗器械生物学评价?系列标准GB/T16886.18材料化学表征GB/T16886.19材料物理化学形态学和外表特性表征GB/T16886.20医疗器械免疫毒理学试验原那么和方法8依据GB/T16886/ISO10993系列标准根本原那么制定了两项医疗器械生物学试验方法的国家标准：GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2局部：生物学试验方法GB/T16175-2021医用有机硅材料生物学评价试验方法1.根本评价试验细胞毒性---GB/T16886.5刺激或皮内反响〔皮肤、皮内、眼、口腔、阴道、直肠、阴茎〕---GB/T16886.10致敏---GB/T16886.10血液相容性〔血栓、凝血、血小板、溶血、补体、血液学〕---GB/T16886.4植入试验〔皮下、肌肉、骨〕---GB/T16886.6全身毒性〔急性全身毒性、重复接触全身毒性〕---GB/T16886.11遗传毒性(AEMS、染色体畸变试验、小鼠淋巴瘤〕---GB/T16886.32.补充评价试验

〔1〕慢性毒性—口、吸入、经皮、静脉、腹膜、植入途径。〔2〕致癌性。〔3〕生殖和发育毒性。〔4〕生物降解—聚合物、金属、合金、陶瓷。医疗器械生物学试验样品制备参考标准：GB/T16886.12-2005〔ISO10993-12:2002)试验样品的选择和制备标准化是保证生物学评价试验结果可靠性和可比性的很关键的一步。在进行试验以及解释试验结果时，应考虑器械在人体应用时的接触性质、程度、频率、时间和条件等因素，其中最关键的因素之一就是试验样品的制备。当制备器械浸提液时，所用的浸提介质和浸提条件应该既与最终产品的性质和用途相适应，又要与试验方法的可预见性〔如试验目的、原理、敏感性等〕相适应。因此理想的浸提条件和试验系统浸提液的应用既要反映产品的实际使用条件，还要反映试验的目的和预测性。医疗器械生物学试验样品的选择1.应采用最终产品、最终产品中有代表性的样品或与最终产品相同的工艺过程制得的材料以及它们的浸提液进行试验。选择的样品必须被证明合理。2.处置试验样品与参照样品时应谨防污染。来自制造过程的任何残留物应视为器械、器械部件或组件的构成局部。〔1〕试验样品如取自非无菌状态，但要求使用前灭菌的器械，试验样品应按照制造厂家推荐的灭菌方法灭菌，必要时，试验应采取无菌操作。〔2〕如果试验样品在灭菌前清洗，应考虑清洗过程和清洗剂对试验样品选择和处置方面的影响。3．如果试验过程要求无菌试验样品，应考虑灭菌或再灭菌过程对试验样品和参照材料的影响。4．当试验样品和参照材料需要分割成小片时，应考虑原先没有暴露的外表〔如腔或切面〕的影响。医疗器械生物学试验样品的选择6.从器械选择有代表性的局部〔1〕如器械不能以整体用于试验时，应选取最终产品中各种材料有代表性的局部按比例组合成试验样品。〔2〕有外表涂层器械的试验样品应包括涂层材料和基质材料，即使基质材料没有和组织接触。〔3〕与病人接触的器械部件在制造过程中如使用了粘结剂、射频密封或溶剂密封，试验样品那么应包括粘接和/或密封处有代表性的局部。〔4〕复合材料应作为最终材料进行试验。〔5〕当一个器械由不同的材料组成，在选择试验样品时，应考虑其潜在的协同作用和相互作用。〔6〕选择的试验样品应能使器械组件最大限度地与试验系统接触，以了解潜在的生物学。浸提条件和方法浸提温度浸提时间浸提比例浸提介质浸提温度和浸提时间可采用以下的一个条件进行浸提：(37±1)℃，〔72±2〕h；(50±2)℃，〔72±2〕h；(70±2)℃，〔24±2〕h；(121±2)℃，〔1±0.1〕h；注：在多数情况下为产品使用适宜的加严条件。对于细胞毒性试验，含血清的细胞培养介质可在(37±1)℃，〔24±2〕h条件下浸提。采用高温浸提时应注意：可能会导致聚合物的交联和/或聚合作用增强；可能会引起材料明显出现降解。可降解材料浸提时要用适当的介质、时间、温度条件来模拟尽可能的过度暴露。完全的溶解是适当的。标准外表积和浸提液体积注：标准的外表积包括样品两面和连接处的面积，不包括不确定外表的不规那么面积。当由于样品外形不能确定其外表积时，浸提时可使用质量/体积。浸提之前应将材料切成小块，以使材料浸没在浸提介质中。由于完整外表与切割外表存在潜在的浸提差异，因此对于弹性体、涂层材料、复合材料、层状薄片等应尽量采用完整的样品进行试验。浸提介质浸提介质例如：极性介质：水、生理盐水、无血清培养皿；非极性介质：各国药典中规定的新鲜精制植物油〔如棉籽油或芝麻油〕；其余介质：乙醇/水、乙醇/生理盐水、聚乙二醇400〔稀释至生理渗透压〕、二甲基亚砜和含血清培养基。浸提液制备的本卷须知浸提应在搅拌的条件下进行。当认为静态适宜时，应对试验方法加以论证、规定并出具报告。如可能,液体浸提液应在制备后立即使用,以防止吸附在浸提容器上或成分发生其他变化。不应调整浸提液的ph值除非给出理由。浸提液一般不应采用过滤、离心或其他方法来去除悬浮的粒子，如果必须进行时，应说明其理由。浸提液制备的本卷须知对于在使用条件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，进行浸提的任何溶剂不应导致聚合物发生分解。聚合材料在挥发性溶剂中只应发生轻微变软〔如小于10%的溶解度〕。如果器械是不能浸提的水状液体，可用液体直接进行试验。在正规使用条件下液体是在器械内循环，可以采用循环方式进行浸提，尽可能加大一个或多个实验条件，如温度、时间、体积、流速。选择这种浸提方式的根本原理应该在报告中注明。细胞毒性试验细胞毒性试验现有版本是GB/T16886.5-2005〔ISO10993-1999〕，GB/T16886.5-20xx〔ISO10993-2021〕正在报批中。敏感性高、重现性好，结果有一定的临床相关性，因此被广泛地应用于医疗器械生物学评价中，特别是作为新材料筛选时的必做试验。国内外无论哪项医疗器械生物学评价标准中都把细胞毒性试验列为首位，作为首选工程。概述定义：该试验采用已建立的细胞系〔ATCCCCL1(NCTCclone929)〕,测定由器械、材料和/或其浸提液造成的细胞溶解(细胞死亡)、以及对细胞生长的抑制和其他影响。意义：该试验属体外试验，能在短期内检出供试品对细胞新陈代谢功能的影响，对毒性物质具有较高的敏感性，从而能快速筛选材料。因此，细胞毒性试验为生物学试验中首选试验工程。〔一〕评价类型简介医疗器械的细胞毒性可以有以下二种评价类型：1.按不同生物学终点评价(1)细胞形态学评价：定性检测方法，结果评价相比照较初浅，通常仅作为一种辅助或补充的方法。(2)细胞膜效应评价：中性红染色法，台盼兰染色法，荧光素染色法等。(3)细胞生长能力评价：细胞增殖度测定。(4)细胞代谢特性评价：ＭＴＴ法、各种测定细胞总蛋白量，蛋白质合成率和酶活性的方法。2.按不同接触方式评价

(1)浸提液方式：将供试品浸在介质介质中，经过一定的时间和温度的作用，取其浸提液与培养的细胞接触。(2)直接接触方式：将供试品直接与培养的细胞接触。(3)间接接触方式：将细胞与供试品隔开，在该体系中上层的供试品可以通过中间介质中的孔隙影响下层的细胞。包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验。常用的细胞毒性试验MTT〔四唑盐〕法：哺乳动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜〔DMSO〕将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该试验用于细胞毒性定量评价。对该试验有干扰的供试品不适于本试验。浸提方法常用浸提方法举例：按照4g/20ml浸提介质的比例，浸提介质为含血清的细胞培养基，〔37±1〕℃，〔24±2〕h。注意：浸提液接触细胞之前，如果进行过滤、离心等处理，应详细记录并对这些步骤加以说明。宜防止对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。细胞毒性结果分析定性评价：分级到达2级以上时被认为有细胞毒性效应。定量评价：细胞活性下降大于30%被认为有细胞毒性反响。细胞毒性结果评价细胞毒性仅仅是一种最初的信号，它预示存在体内毒性的可能性，事实上单凭细胞毒性数据还未必能确定该器械一定不适用于特定的临床应用在对细胞毒性的结果评价时需要结合其他生物相容性数据和产品的预期用途进行综合评价。在解释试验数据时还必须考虑到该试验系统的局限性。刺激试验刺激是不涉及免疫学机制的一次、屡次或持续与试验材料接触所引起的局部炎症反响。要测定器械、材料及其潜在可溶出物的刺激作用，试验的进行应与使用或接触的途径和持续时间相适应。刺激试验具有较高的敏感性，是医疗器械三项根本生物学评价工程之一。刺激试验类型皮肤刺激皮内反响特殊的刺激试验：眼、口腔、阴茎、直肠和阴道刺激等注：任何显示为皮肤刺激物或pH≤2.0或≥11.5的材料也不宜再进行试验，宜标示为潜在的眼刺激物。任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不应再进行试验，可标示为潜在的口腔、阴茎、直肠、阴道组织组织刺激物。任何显示为皮肤、眼、黏膜组织刺激物的材料，或是pH≤2.0或≥11.5的材料，不应进行皮内试验。皮内反应试验结果评价

对一些广泛应用于人体正常或损伤皮肤的产品,一般不允许对皮肤有实质性危害存在。在某些情况下，阳性试验剂量不一定就判定材料不能使用。致敏试验定义：免疫介导的对某种物质的皮肤反响。该试验属体内试验，方法学相比照较成熟，灵敏性较高，因此为各类医疗器械必须评价的工程之一。方法最大剂量法封闭斑贴法小鼠局部淋巴结试验〔LLNA〕试验结果评价按本标准试验步骤得出的试验结果不能单独成立。阴性试验结果往往不能排除产品可能导致皮肤过敏反响的可能性。出现阳性试验结果有时不一定就说明器械或材料不能使用。全身毒性试验急性全身毒性亚急性全身毒性亚慢性全身毒性慢性毒性热原反响重复接触全身毒性试验

定义急性全身毒性：在24h内一次、屡次或持续接触试验样品后在任何时间发生的不良作用。注：与药典上的异常毒性试验不同。亚急性全身毒性：在24h～28d内屡次或持续接触试验样品后发生的不良作用。亚慢性全身毒性：反复或持续接触试验样品后在动物寿命期的某一阶段发生的不良作用。慢性全身毒性：在动物的主要寿命期内反复或持续接触试验样品后发生的不良作用。重复接触全身毒性试验接触途径接触剂量接触时间接触途径GB/T16886.11-2021中规定，医疗器械或其可沥滤物可通过多种接触途径进入人体，亚慢性〔亚急性〕全身毒性试验最好采用具有临床相关性的接触途径，如采用其他接触途径应予以论证。接触方式有皮肤、植入、吸入、皮内、肌内、腹腔、静脉、经口、皮下等。接触剂量对于较长期试验，宜包括至少三种剂量水平和适当的对照组。采用一种适宜的试验样品剂量进行单剂量组试验可判定是否存在毒性危害〔即限度试验〕，但其他多剂量或剂量反响试验要求多个剂量组来判定毒性反响。如准备采用加严剂量，可增加剂量组。剂量频率：应具有临床相关性。在重复接触试验中，试验周期内动物最好每周7日接触试验样品。剂量体积：GB/T16886.11-2021中附录B规定试验样品接触最大剂量体积，但不应做为常规接触剂量的选择。结果评价观察工程：体重变化、临床观察、临床病理学、大体病理学、器官称重、组织病理学等。综合分析各指标，判定是否具有“生物学相关性〞。应注意此类试验的局限性，对结果进行科学的判断。热原试验致热性是某种化学制剂或其他能产生发热反响物质的一种特性。本局部所涉及的是材料介导的致热性。常用方法是将材料浸提液由静脉注入兔内，在一定时间内观察兔体温变化，以判断在材料或浸提液中所含热原量是否符合人体应用要求。只做该项试验尚不能区分热原反响是因材料本身还是因内毒素污染所致。只有同细菌内毒性试验相结合才能做出热原反响是否是因材料致热性所致。内毒素介导的致热性这种致热形式源自于革兰氏阴性细菌的生物活性内毒素，通常为医疗器械制造过程中的诱导发热的污染物，可采用特异性细菌内毒素试验〔鲎试剂法〕测定器械内毒素含量来进行评价。材料介导的致热性该类型致热性为非内毒素相关因素引起，

一般认为，热原试验主要适用于与循环血液接触的器械。ASTM规定，与中枢神经系统和胸腔接触的器械也要进行热原试验。注：热原试验是静脉注射，需要考虑浸提液的状态。遗传毒性试验目的：使用哺乳动物或非哺乳动物细胞培养或其他技术来测定由医疗器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及其他DNA或基因毒性。遗传毒性实验策略：优先体外试验，方案1：细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物细胞诱导性试验.方案2：细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验〔覆盖诱裂性和基因突变〕。遗传毒性实验策略：如果体外试验出现阳性，应进行体内诱变性试验。常用体内试验包括啮齿动物微核试验、啮齿动物骨髓中期分析、哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验。血液相容性试验目的：血液相容性试验用一个相应的模型或系统评价与血液接触的医疗器械或材料对血液或血液成分的作用。血液相容性试验方法：血栓形成、凝血、血小板、血液学〔溶血、白细胞计数、白细胞活化、网织红细胞计数〕、补体系统血液相容性溶血试验：供试品的溶血率应小于5%。血

生殖毒性试验试验目的：评价试验样品对生殖功能、胚胎发育〔致畸性〕以及胎儿和早期婴儿发育潜在影响。生殖毒性试验可能需要进行生殖及发育毒性试验的材料或器械：1.与生殖组织或胚胎〔胎儿〕直接长期或永久接触的器械。2.储能医疗器械。3.可吸收材料或可溶出物质。〔如在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或者材料或医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无生殖和发育毒性时，就无需进行试验。重点试验60内容细胞毒性试验1植入后局部反响试验2刺激和致敏试验3细胞毒性的定义根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义,细胞毒性是指由产品、材料及其浸提物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。ISO10993.5-2021的定义：Cytotoxicityisanirreversibledamagetolivingcells.对活细胞不可逆的损害。细胞毒性试验是运用哺乳动物细胞体外培养技术，检测医疗器械/材料引起的细胞生长抑制，溶解死亡等毒性作用。体外细胞毒性试验的特点对毒物高度敏感。试验周期短，可用于快速筛选。试验方法标准化，试验结果重复性好，便于实验室之间的结果比对。体外细胞毒性试验具有通用性,广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。琼脂扩散滤膜扩散细胞毒性试验浸提液试验直接接触试验间接接触试验定性显微镜观察法MTT

XTT

中性红摄取集落形成

定量ISO10993.5-2021ISO10993-5:2021和GB/T16886.5-2003(ISO10993-5:1999)的区别新标准修订内容如下：修改了“材料浸提液的制备〞、“试验步骤〞“结果评价〞等相关内容，给出了细胞毒性定性和定量评价指标；—增加了“附录A中性红摄取(NRU)细胞毒性试验〞；—增加了“附录B集落形成细胞毒性试验〞；—增加了“附录CMTT细胞毒性试验〞；—增加了“附录DXTT细胞毒性试验〞。细胞毒性测定中所使用的大量终点测定方法可分成以下评价类型：

—按形态学方法评定细胞损伤；

—细胞损伤的测定；

—细胞生长的测定；

—细胞代谢特性的测定。 ISO10993-5:2021术语和定义

近集合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞融合。空白blank不含试验样品的浸提介质，浸提期间置于与试验样品相同的器皿中，并经受与试验样品相同的条件。

浸提液试验浸提液试验结果的重现性稳定。样品与其他类似器械或材料的结果在实验室内部和各实验室间的水平上具有可比性。浸提液试验被普遍认可。a)含血清培养基;b)生理盐水溶液;c)其他适宜的介质。含血清培养基是首选的浸提介质，优先选用含血清培养基用于浸提是由于其具有支持细胞生长以及浸提极性和非极性两种物质的能力。除了含血清培养基，在明确要浸提极性物质〔例如离子化合物〕时宜考虑采用无血清培养基。其他适宜的介质包括水和二甲基亚砜〔DMSO〕。在所选择的测试系统中,DMSO如高于0.5％〔体积分数〕时有细胞毒性。与含血清培养基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀释度较大，溶出物的细胞接触浓度会比较低。

浸提介质

含血清培养基按照a)〔37±1〕℃规定的浸提条件，因为浸提温度超过〔37±1〕℃会对血清化学和/或血清稳定性以及培养基中其他成分产生不良影响。浸提液接触细胞之前，如果进行过滤、离心或用其他方法处置，最终报告中对此应详细记录并对这些步骤加以说明，对浸提液pH值的调整也应在报告中说明。宜防止对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。浸提条件

细胞系优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取。假设贮存某一原种培养细胞系时,那么应将其放在相应培养基内,在－80℃或－80℃以下冻存，培养基内加有低温防护剂,如二甲基亚砜或甘油。长期贮存〔数月至数年〕只能在－130℃或－130℃以下冻存。培养基培养基应无菌。含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。培养基中可含有对试验无不良作用的抗生素。

原种培养细胞制备用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。使用存储细胞时,如加有低温防护剂要除去,使用前至少传代培养一次。传代培养细胞时,采用适合细胞系的酶分散法和/或机械分散法。

试验步骤平行样数应至少采用三个平行试验样品数和对照品数。浸提液试验本试验用于细胞毒性定性和定量评定。试验宜在近集合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。试验开始前用显微镜验证培养细胞的近集合和形态学情况。经过至少24h的培养后，确定细胞毒性反响。

细胞毒性的测定可采用定性或定量方法测定细胞毒性反响。定性评价:用显微镜检查细胞，必要时采用细胞化学染色，评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和胞膜完整性等方面的改变。在试验报告中应描述性地或以数字记录正常形态的变化，表1给出了用于对试验样品分级的方法。表1浸提液细胞毒性形态学定性分级级别反应程度全部培养细胞观察0无胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解，无细胞增殖下降情况1极轻微不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解；仅观察到极轻微的细胞生长抑制现象。2轻度不超过50%的细胞呈圆缩、无胞浆内颗粒，无大范围细胞溶解；可观察到不超过50%的细胞生长抑制现象。3中度不超过70%的细胞层包含圆缩细胞或溶解细胞；细胞层未完全破坏，但可观察到超过50%的细胞生长抑制现象4重度细胞层几乎完全或完全破坏正常开始正常中间正常结束正常细胞给毒后的细胞形态：阴性对照空白对照阳性对照四级结果浸提液试验的定量评价定量评价:测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞增殖或克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放、活体染料的复原或其他可测定的参数进行定量测试。试验报告中应记录使用的方法和反响。ISO10993-5：2021规定细胞活性下降大于30%被认为有细胞毒性反响。

ISO10993-5：2021附录C〔资料性附录〕MTT细胞毒性试验原理通过细胞代谢活性测定细胞的存活率。MTT黄色水溶液

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)在活细胞内代谢性减少，生成蓝紫色不可溶的甲瓒。甲瓒溶于异丙醇后用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。试验步骤根本步骤L929细胞接种至96孔板，维持培养24h〔～1倍周期〕，至形成半集合单层。然后与系列浓度试验化合物接触。接触24h后测定每一试验浓度甲瓒形成，与对照培养细胞的甲瓒形成进行比较。计算每一试验浓度生长抑制百分比。材料试验用细胞系采用L929细胞(NCTCclone929:CCL1,AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA;ECACCNo.88102702,EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK)，试验用细胞应无支原体感染。试验质量检查〔Ⅰ〕:阳性对照(PC)和阴性对照(NC)试验质量检查〔Ⅱ〕：空白未经处理空白的光密度〔OD570〕绝对值可说明，在试验的两天内以每孔1×104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。空白OD570平均值如≥0.2，那么试验符合接受标准。为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕两侧。左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，那么试验符合接受标准。对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价那么可免除两列空白的操作。

MTT细胞毒性试验操作流程时间

h步骤00:00接种96孔板：1×104个细胞/100µLMEM培养基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培养基↓24:00加入用试验用培养基制备的≥4个浓度的试验样品浸提液（100µL）(未处理空白=试验用培养基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形态学改变的显微镜评价除去培养基加入50µLMTT溶液孵育（37℃/5%CO2/2h）↓51:00除去MTT溶液每孔加入100µL异丙醇震荡滴定板↓51:30在570nm测量吸光度（参照650nm）数据记录试验样品〔100%浸提液〕组试验细胞存活率下降至如<空白组试验细胞存活率的70%，那么具有潜在的细胞毒性。ISO10993-5：2021附录D〔资料性附录〕XTT细胞毒性试验原理通过线粒体脱氢酶的测定反响细胞的存活率。XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide)与线粒体脱氢酶反响，生成水溶性甲瓒。用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。细胞系采用L929细胞(NCTCclone929:CCL1,AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA;ECACCNo.88102702,EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK)，细胞培养物应无支原体。试验质量检查〔Ⅰ〕:阳性对照(PC)和阴性对照(NC)每项细胞毒性试验都包括阳性对照和阴性对照。试验质量检查〔Ⅱ〕：空白未经处理空白的光密度〔OD450〕绝对值可说明，在试验的两天内以每孔1×104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。空白OD450平均值如≥0.2，那么试验符合接受标准。为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕两侧.左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，那么试验符合接受标准。对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价那么可免除两列空白的操作。

XTT细胞毒性试验操作流程时间h步骤00:00接种96孔板：1×104个细胞/100µLMEM培养基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培养基↓24:00加入用试验用培养基制备的≥4个浓度的试验样品浸提液（100µL）(未处理空白=试验用培养基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形态学改变的显微镜评价加入50µLXTT/PMS溶液孵育（37℃/5%CO2/3h～5h）↓51:00震荡平板每孔中吸出100µL加到新平板中↓51:30在450nm测量吸光度（参照630nm）数据分析活细胞数减少是由于样品中线粒体脱氢酶总活性降低，这直接与生成的橙色甲瓒量有关，在450nm测量光密度。与空白比较计算存活率下降情况。数据记录试验样品〔100%浸提液〕组试验细胞存活率下降至如<空白组试验细胞存活率的70%，那么具有潜在的细胞毒性。ISO10993.5-2021附录A〔资料性附录〕

中性红摄取(NRU)细胞毒性试验概述将BALB/c3T3细胞接种至96孔平板内并维持培养24h〔～1倍周期〕，至形成半集合单层。然后与系列浓度的试验混合物接触，24h后测定每一试验浓度的NRU并与对照培养细胞测定进行比较。BALB/c3T3细胞、clone31〔如ECACC86110401，EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK；CCL-163，AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA)和从CCL-163[ATCC]制备的JCRB9005〔HumanScienceResearchResourcesBank,Osaka,Japan〕。细胞系试验质量检查〔Ⅰ〕:阳性对照(PC)细胞毒性试验应包括阳性对照。多数化学物有历史资料或实验室内、实验室间重复试验的支持，十二烷基硫酸钠〔SLS,CAS#151-21-3〕即是最经常用于试验的一种化学物，因此推荐作为阳性对照。在使用SLS时推荐四个浓度标度：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL。SLS的IC50历史平均值(Spielmannet.al.,1991[10])为0.093mg/mL。95%置信区间为0.070mg/mL至0.116mg/mLSLS的IC50如在95%置信区间，那么试验符合标准。推荐使用阳性参照材料和阴性参照材料试验质量检查〔Ⅱ〕：空白未经处理空白的光密度〔OD540〕绝对值可说明，在试验的两天内以每孔1×104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。空白OD540平均值如≥0.3，那么试验符合接受标准。为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕两侧。左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，那么试验符合接受标准。对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价那么可免除两列空白的操作。试验质量检查〔Ⅲ〕：浓度-反响质量检查由浓度-反响得出的IC50宜至少有两个或三个〔NRU抑制率在10%和90%之间的反响作为支撑。否那么，浓度稀释因子可能易于降低，放弃该试验并采用较小的稀释因子重复试验。

3T3NRU细胞毒性试验操作流程时间

h步骤00:00接种96孔板：1×104个细胞/100µLDMEM培养基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培养基↓24:00加入用试验用培养基制备的8个浓度的试验样品浸提液（100µL）(未处理空白=试验用培养基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形态学改变的显微镜评价除去试验用培养基用150µLPBS冲洗一次加入100µLNR培养基孵育（37℃/5%CO2/3h）51:00倾倒出NR培养基用150µLPBS冲洗一次加入150µLNR洗脱液定色（乙醇/乙酸液）↓

51:40震荡滴定板10min

51:50在540nm测量NR吸光度（即细胞活性）

样品浸提液最高浓度〔100%浸提液〕的细胞相对活性如≥对照组的70%，材料应被认为无细胞毒性。浸提液如显示细胞毒性反响，计算每一试验浓度〔即试验化学物浓度〕的生长抑制率。从浓度反响计算IC50〔即产生50%NRU复原的浓度〕，以浸提液稀释百分比表示。浸提原液为100%浸提液。

数据分析ISO10993-5：2021附录B〔资料性附录〕

集落形成细胞毒性试验试验概述将V79细胞加到6孔板中，保持培养24h至开始对数生长阶段。然后与系列浓度的试验物接触，孵育6天，于集落较大时计数。用甲醇固定集落，吉姆萨液染色并计数。细胞系V79细胞〔JCRB0603,HumanScienceResearchResourcesBank,Osaka,Japan；或美国和欧洲细胞库的其他细胞〕注：推荐使用V79细胞，因为其能形成大并清晰的集落。试验质量检查〔Ⅰ〕:阳性对照(PC)阴性材料(NC)细胞毒性试验应包括阳性对照和阴性对照。如ZDEC和ZDBC。ZDEC的IC50宜不超过7%。ZDBC的IC50宜不超过80%。试验质量检查〔Ⅱ〕：空白空白集落平均数如至少为细胞板每孔细胞数目的70%，那么试验符合接受标准。试验质量检查〔Ⅲ〕：浓度-反响质量检查由浓度-反响得出的IC50宜至少有两个或三个对照抑制率在10%和90%之间的反响作为支撑。否那么，浓度稀释因子可能易于降低，放弃该试验并采用较小的稀释因子重复试验。试验步骤注意：原种细胞解冻后，细胞在用于试验之前要传代2～3次。第1天用MEM05培养基制备33.3个细胞/mL的细胞悬液。6孔板的每孔参加3mL细胞悬液。第2天孵育24h后从每孔中吸出培养基。参加2mL用MEM05培养基制备的100%浸提液或稀释浸提液。每一浓度平行制备3孔。置培养箱再孵育6天。第8天从每孔中吸出培养基，用PBS冲洗每一孔，参加甲醇固定集落，再用5%吉姆萨液染色。计算每一孔集落数目。结果表示集落形成细胞毒性试验平板效率如≥对照组的70%，材料应被认为无细胞毒性。浸提液如对细胞显示细胞毒性作用，计算IC50(浓度抑制率至50%)，以浸提液百分比表示。注：平板效率：对照组集落数目除以浸提液组集落数目，以百分数表示系数。直接接触试验本试验用于细胞毒性定性和定量评价。在每只器皿中央部位的细胞层上各小心地放置一个试验样品的试样,确保试样覆盖细胞层外表约十分之一。适当的培养周期〔最少24h〕。按表2确定细胞毒性反响。间接接触试验-琼脂扩散试验本试验用于细胞毒性定性评价。不适用于不能通过琼脂层扩散或可能与琼脂相互作用的可沥滤物。将试验样品的试样小心地放在每只器皿的固化琼脂层上,确保试样覆盖细胞层外表约十分之一。适当的培养周期〔培养24h～72h〕。按表2确定细胞毒性反响。间接接触试验-滤膜扩散试验本试验用于细胞毒性定性评价。孔径0.45μm、无外表活性剂的滤膜。将试验样品的试样小心地放到滤膜无细胞面的上面。滤膜上放置不产生反响的环,用以保存浸提液和新参加的混合物。适当的培养周期〔培养2h±10min〕。按表2确定细胞毒性反响。表2琼脂和滤膜扩散试验及直接接触试验反响分级级别反应程度反应区域观察

0无试样周围和试样下面未观察到反应区域

1极轻微试样下面有一些畸形细胞或退化细胞2轻度反应区域局限在试样下方范围3中度反应区域超出试样尺寸1.0cm

4重度反应区域超出试样1.0cm以上植入后局部反响试验ISO10993-6:2007和GB/T16886.6-1997〔ISO10993-6:1994〕的区别：新标准修订内容如下：修改了“范围〞，适用范围增加可降解和/或可吸收性材料；修改了“植入试验方法通那么〞、“评价和试验报告〞、“肌肉植入中植入样品的数量〞等相关内容；增加了“试验方法的根本方面〞；增加了“附录A可降解/可吸收性材料植入周期和组织反响的根本考虑〞；增加了“附录E植入后局部生物学反响评价举例〞。概述植入后局部反响试验是把医疗器械材料植入实验动物肌肉，皮下组织，骨组织中，在一定周期后，通过肉眼观察和显微技术评价植入部位和周围组织反响情况，样品对活体组织的局部毒性作用。可能需要进行植入试验的样品〔一〕组织反响的根本过程1炎症期：以炎症细胞渗出和浸润为主，〔1〕早期主要以中性粒细胞和淋巴细胞为主；〔2〕后期出现以淋巴细胞、单核细胞〔巨噬细胞〕、浆细胞为主的反响--细胞成分可因材料的不同而不同。一般2-4周炎症反响最强，以后逐渐减弱，3个月后炎症反响应根本消失。例如：纤维蛋白胶：浆细胞和嗜酸粒细胞；胶原蛋白材料：淋巴细胞和异物细胞；

2纤维组织化期：在炎症期的炎症反响外侧出现纤维母细胞为主的肉芽组织，随着炎症反响的消退，以及纤维细胞增生和分泌胶原纤维，纤维细胞逐渐减少，最终被纤维组织形成的包囊包裹。〔二〕植入部位试验样品应植入与材料临床应用最相关的组织：1〕肌肉植入2〕皮下植入3〕骨植入4〕特殊部位植入植入方式肌肉植入皮下组织植入骨植入

肌肉植入皮下植入骨植入肌肉植入试验把一定大小形状的试验样品植入实验动物的肌肉组织，同样植入标准对照材料，对照材料是已确立临床可接收性和生物相容性良好的同类样品材料。定期采集标本和周围组织，肉眼和显微镜下比较观察试验样品和对照材料引起的组织生物学反响。皮下组织植入试验用于评定皮下组织对植入材料的生物学反响。对试验样品植入物与对照样品植入物的生物学反响进行比较，对照材料是已确立临床可接受性和生物相容性的医疗器械所采用的材料。骨植入试验把植入物插入实验动物的骨组织内，对试验样品植入物与对照样品植入物的生物学反响进行比较，对照材料是已确立临床可接收性和生物相容性良好的同类样品材料。实验动物实验用兔被普遍选用。对于短期试验，通常使用啮齿动物或家兔。对于长期试验，啮齿动物、家兔、犬、绵羊、山羊、猪及其他平均寿命相对较长的动物比较适宜。〔三〕样品制备应根据最终产品预期所用方法对每个植入样品进行制造、处理、污染物的清洗和灭菌，并应在研究文件中进行确认。皮下植入样品制备样品状态a)薄片材料应制成直径10mm～12mm、厚度0.3mm～1.0mm的试验样品。b)块状材料应制成直径1.5mm、长5mm、两端为圆头的试验样品。c)非固体试验样品〔包括粉剂〕应装入直径1.5mm、长5mm的导管内。样品数量：每种材料和每一植入期至少采用3只动物和足够的植入部位，总数到达10个试验样品和10个对照样品。肌肉植入样品制备样品状态：宽1mm～3mm、长度约10mm较大样品：直径10mm、厚度3mm样品应制成圆形边缘，两端抛光至纯圆半径。样品数量：每一植入期至少采用3只动物和足够的植入部位，总数到达10个试验样品和10个对照样品。骨植入样品制备样品状态：家兔：直径2mm、长6mm的圆柱体样品数量：每一植入期应评价至少10个试验样品和10个对照样品。〔四〕试验周期试验周期应根据临床可能接触时间来确定，或是持续至相应生物学反响到达或超过某一稳定状态。选择的时间点应进行说明和论证。非降解、非吸收性材料：1〕短期反响：1周到4周；2〕长期反响：12周以上。结论结论：在本试验以下情况下，试验样品判定为：—无刺激〔0.0～2.9〕—轻微刺激〔3.0～8.9〕—中度刺激〔9.0～15.0〕—重度刺激〔>15〕与阴性对照样品比较组织反响。生物降解试验参考标准：GB/T16886.6试验周期应与植入部位、植入物的尺寸、估计的降解时间相关。可降解/可吸收性材料植入周期和组织反响的根本考虑应对植入物各时间点与降解过程相关的局部组织反响进行评价〔不推荐单一的植入时间点〕：a)发生降解时；b)中期降解阶段；c)到达稳定状态时，组织恢复或接近完全降解〔一般需要到达或超过吸收终点，即完成预期的重塑和修复的最终组织反响或生物反响恢复至正常组织学〕。刺激与皮肤致敏试验

ISO10993-10:2021和GB/T16886.10-2005(ISO10993-10:2002)的区别新标准修订内容如下：修改了标准名称；修改了术语和定义；取消了原“5.4材料鉴别〞；皮内反响试验由附录B调整到正文中；人体皮肤刺激试验方法由正文调整到附录C；皮肤致敏试验增加小鼠局部淋巴结检验法；增加了附录D体外皮肤刺激试验；增加了附录E聚合物试验材料浸提液制备方法。皮肤致敏试验

概念皮肤致敏skinsensitization变应性接触性皮炎。免疫介导的对某种物质的皮肤反响。是一种免疫应答反响。目前三种测定化学物潜在皮肤致敏性的动物试验最大剂量致敏试验(GPMT)封闭式贴敷试验(Buehler试验)小鼠局部淋巴结试验〔LLNA〕皮肤致敏试验GPMTBTLLNA皮肤评分致敏性评价BrDU淋巴细胞分析皮肤致敏试验豚鼠最大剂量试验(GPMT)：最敏感的方法封闭式贴敷试验(Buehler试验)：适用于局部应用产品。小鼠局部淋巴结试验〔LLNA〕：豚鼠试验的唯一替代试验，用于检验单一化学物，并且目前为化学物的首选测定法。注：全部三种方法被开发用于测定化学物的致敏潜能，即接触性皮炎、迟发型〔Ⅳ型〕超敏反响最大剂量致敏试验(GPMT)经皮内注射诱导，斑贴激发的方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反响，以评价样品是否具有引起迟发性超敏反响的潜能。最大剂量致敏试验适用范围适用于评价与人体接触所有类型的产品及其浸提液。最大剂量致敏试验过程皮内诱导阶段〔试验样品皮下注射〕→7天后局部诱导阶段〔试验样品敷贴48小时〕→14天后激发阶段〔试验样品敷贴24小时〕→结果观察24小时和48小时。Magnusson和Kligman分级敷贴试验反应等级无明显改变0散发性或斑点状红斑1中度融合性红斑2重度红斑和/或水肿3GPMT阳性试验〔0.1%DNCB〕

结果评价按Magnusson和Kligman分级标准，对照组动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物分级大于或等于1时，试验组动物反响超过对照组中最严重的反响那么认为致敏。小鼠局部淋巴结试验〔LLNA〕在小鼠耳背部局部处置某一试验样品后，测定鼠耳应用部位引流淋巴结内淋巴细胞的增殖程度。指定某种试验材料为致敏物，其临界值是与对照活性比较细胞增殖应答为3倍或更多。封闭贴敷试验(Buehler试验)采用封闭斑贴诱导，激发方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反响，以评价样品是否具有引起迟发性超敏反响的潜能。封闭贴敷致敏试验适用范围适用于预测中度至重度致敏物，不能采用最大剂量致敏试验法的样品或接触表皮的样品。封闭贴敷致敏试验过程诱导阶段〔一周敷贴3次，每次6小时。连续3周〕→→14天后激发阶段〔试验样品换位敷贴6小时〕→结果观察24小时和48小时。

结果评价同最大剂量致敏试验

刺试激验定义刺激(irritation)：一次、屡次或持续与一种物质〔材料〕接触所引起的局部非特异性炎症反响。注：皮肤刺激是一种可逆反响，主要以皮肤红斑〔发红〕为特征。非免疫应答反响。分类皮肤刺激皮内反响粘膜刺激阴道刺激直肠刺激阴茎刺激口腔粘膜刺激眼刺激首选试验动物为家兔口腔粘膜刺激试验动物为金黄地鼠动物选择动物皮肤刺激试验采用相关动物模型对材料在试验条件下产生皮肤刺激反响的潜能做出评定。模拟样品临床使用，将样品或样品浸提液直接贴敷于动物皮肤上，在规定的时间内观察动物皮肤反响，以评价样品是否具有潜在的皮肤刺激作用。动物皮肤刺激试验适用范围适用于预期与人体正常或损伤皮肤接触的医疗器械和材料动物皮肤刺激试验试验动物健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一品系，体重不低于2kg。使用数量3只如预期有刺激反响，初试应考虑使用1只动物。除非出现明显的阳性反响红斑或水肿记分大于2，否那么应至少再使用2只动物进行试验。

试验步骤动物准备试验前4h～24h将动物背部脊柱两侧被毛除去(约10cm×15cm区域)。试验样品的应用粉剂或液体样品将0.5g或0.5mL的试验材料直接置于皮肤。固体和疏水性材料无需湿化处理，粉剂使用前宜用水或其他适宜的溶剂稍加湿化。用2.5cm×2.5cm非封闭式的敷料(如吸收性纱布块)覆盖接触部位，然后用绷带〔半封闭性或封闭性〕固定敷贴片至少4h。接触期结束后取下敷贴片，用持久性墨水对接触部位进行标记。样品浸提液将相应的浸提液滴到2.5cm×2.5cm大小的吸收性纱布块上，浸提液的用量以能浸透纱布块为宜，一般每块纱布滴0.5mL，按图1所示部位敷贴于动物背部两侧。用绷带〔半封闭性或封闭性〕覆盖敷贴部位至少4h。接触期结束后取下敷贴片，用持久性墨水对接触部位进行标记，并用适当的方法除去残留试验材料。动物皮肤刺激试验部位结果评价单次接触试验按以下规定确定原发性刺激指数(PII)。观察时间(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h将每只动物全部原发性刺激记分相加后再除以动物总数〔一般为3〕得出试验样品原发性刺激指数。当采用空白或阴性对照时，计算出对照原发性刺激记分，将试验材料原发性刺激记分减去该记分，即得出原发性刺激记分。皮肤刺激记分系统反应刺激计分红斑和焦痂形成

无红斑0极轻微红斑(勉强可见)1清晰红斑2中度红斑3重度红斑(紫红色)至无法进行红斑分级的焦痂形成4皮肤刺激记分系统〔续〕水肿形成

无水肿0极轻微水肿(勉强可见)1