hplc-elsd法测定奥美拉唑钠中钠离子含量

hplc-elsd法测定奥美拉唑钠中钠离子含量

为了改善药物的溶解、理化稳定性、生产工艺特点和生物药剂学特性，许多药物都是以盐的形式生产的。因我国仿制药生产企业较多,不同企业生产的原料药可能有不同的成盐形式存在,以奥美拉唑(omeprazole,OME)为例,目前国内市售的奥美拉唑以及S-奥美拉唑(esomeprazole,通用名:埃索美拉唑)原料有奥美拉唑、钠盐(图1)、镁盐(图2)以及锌盐供应,以用于不同制剂的开发。目前有研究采用滴定法测定奥美拉唑镁盐中镁离子的含量,尚未见测定钠离子含量的报道。目前,借助于键合有两性离子交换基团的色谱固定相(zwitterionicstationaryphase)和通用性检测器,如电喷雾检测器(chargedaerosoldetection,CAD)或蒸发光散射检测器(evaporatinglightscatteringdetector,ELSD),可以在常规液相色谱系统中对药物的常见阴、阳成盐离子实现快速分析;但部分药物分子例如头孢曲松、博宁霉素等会强保留于色谱柱中,很难洗脱甚至造成不洗脱。在对头孢曲松钠的钠离子测定中,方法准确度好,但方法精密度较低(RSD在2%~6%之间)。本研究在以往研究基础上,(1)利用键合两性离子交换基团的色谱固定相,建立测定奥美拉唑钠中钠离子含量的方法;(2)选择奥美拉唑钠、头孢曲松钠和盐酸博宁霉素分别代表药物分子在色谱过程中不保留、强保留和不洗脱3种状态,通过统计分析(t-检验、ANOVA等),考察药物分子洗脱状态对化学药物成盐离子含量测定方法准确性的影响,以更好地阐述新型混合模式色谱柱的应用范围。1仪器和试剂盒1.1自动进样器和紫外过滤器HPLC-UV-ELSD仪(简称仪器A)主要用于方法开发以及大部分方法学验证实验:岛津20A液相色谱系统(包括LC-10AT型双输液泵;DGU-12A型在线脱气机;SIL-10A型自动进样器;CTO-10A型柱温箱;SPD-10A型二极管阵列检测器,检测波长254nm;Alltech蒸发光散射检测器;数据处理软件为CLASS-VP),美国Alltech公司。HPLC-UV-ELSD仪(简称仪器B)用于方法学验证的中间精密度以及粗放性研究:Ultimate3000型液相色谱系统(包括双三元输液泵系统;紫外检测器,检测波长254nm;Alltech蒸发光散射检测器;带温控的自动进样器,进样器温度为4℃;数据处理软件为ChromLeon),美国Dionex公司。Milli-Q超纯水系统,法国Millipore公司。1.2其他化学成分待测样品为奥美拉唑钠待标定化学对照品1批(批号100760-201202),由中国食品药品检定研究院提供。氯化钠工作基准品(氯化钠,工作基准品级别,含量99.95%~100.05%,以100.0%计,批号20000318,由北京益利精细化学品有限公司提供);醋酸铵(CH3COONH4,AR级别,含量≥99.5%,批号20080126,由国药集团化学试剂有限公司提供);氯化钾(KCl,AR级别,含量≥99.5%,批号F20100713,由国家集团化学试剂有限公司提供);硫酸锂(Li2SO4·H2O,AR级别,含量≥99.0%,批号20060405,由天津市禄晨化学试剂厂提供);无水氯化钙(CaCl2,AR级别,含量≥96.05%,批号F20070731,国药集团化学试剂有限公司提供);冰醋酸(CH3COOH,AR级别,含量≥99.5%,批号20091020,由北京化工厂提供);乙腈(CH3CN,色谱纯,含量≥99.9%,批号100606,由FisherScientific提供)。2实验方法2.1离子峰位的确定精密称定氯化钾11.75mg、氯化钠基准品17.60mg、硫酸锂12.05mg、碳酸氢钠10.50mg、无水氯化钙29.02mg、醋酸铜15.03mg、硫酸镁17.3mg、奥美拉唑钠对照品12.51mg,分别置10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,即得用于确定各离子峰位的溶液;精密量取上述各溶液1mL,于同一10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液稀释至刻度,摇匀,即得。2.2对照品储备液的制备取氯化钠工作基准品(含量以100.0%计)适量,105℃干燥至恒重后,精密称定49.24mg,置50mL量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液(以钠离子计,浓度为387.4μg·mL-1);另精密量取对照品储备液1.0mL,分别置200、100、50、25、10和5mL量瓶中,用50%乙腈水溶液依次稀释至刻度,摇匀,分别制成从低浓度到高浓度的系列对照品溶液(以钠离子计浓度分别为1.94、3.87、7.75、15.50、38.74、77.48μg·mL-1)。2.3供试品溶液的制备取样品细粉约12.5mg,精密称定,置25mL量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液(浓度为0.5mg·mL-1)。2.4otno.063-331系统的适用性试验色谱条件:Ⅰ号和Ⅱ号色谱柱均为混合模式色谱柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm,购自美国Dionex公司),但批号不同,Ⅰ号色谱柱主要用于方法开发以及大部分方法学验证实验,批号为LotNo.006-04-062,Ⅱ号色谱柱用于中间精密度、耐用性研究以及样品测定,批号为LotNo.006-04-031;以30mmol·L-1醋酸铵缓冲液(取醋酸铵4.59g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸调节pH至5.21,加入乙腈100mL)-乙腈(50∶50,v/v)为流动相,流速为0.3mL·min-1;柱温25℃;以Alltech蒸发光散射检测器检测,漂移管温度90℃,氮气作为载气,流速为2.6L·min-1。系统适用性试验:取氯化钠对照品溶液,注入液相色谱仪,调节流动相中有机相比例,使钠离子主峰的保留时间约5~8min,钠离子峰与奥美拉唑峰的分离度应大于3.0,钠离子峰与氯离子峰的分离度应大于10。测定法:精密量取“2.2”项下氯化钠对照品溶液20μL,分别注入液相色谱仪,以对照品溶液浓度(X,μg·mL-1)与相应峰面积(Y)进行二阶多项式回归(Y=aX2+bX+c),回归方程的相关系数(r)应不小于0.99;再精密量取“2.3”项下供试品溶液进样20μL,以钠离子峰面积用二阶多项式回归方程按下述公式(1)计算出钠离子含量(μg·mL-1)。3结果与讨论3.1hplc-elsd法测定奥隆钠钠的钠离子含量3.1.1专业3.1.1.色谱柱的选择将“2.1”项制备的混合溶液进样20μL,记录色谱图至钠离子峰保留时间的6倍以上,各峰按顺序依次洗脱:奥美拉唑、Li+、Na+、K+、Mg2+、Cl-、Ca2+(图3);而其他离子Zn2+、SO42-、HCO3-等在此色谱条件下不洗脱,需要选择其他类型色谱柱;虽奥美拉唑峰与相邻锂离子峰分离度为1.1,但不影响钠离子峰定量。3.1.1.奥美拉唑峰与钠离子的色谱质谱条件分别取“2.2”、“2.3”项下制备的氯化钠对照品溶液、供试品溶液进样20μL,结果见图4,钠离子峰与氯离子峰之间的分离度为18.53,在此色谱条件下,奥美拉唑峰与钠离子完全分离,不干扰钠离子测定。3.1.2钠离子进样浓度对测定钠离子的影响分别精密吸取“2.2”项下的氯化钠对照品溶液(即含相当于钠离子1.94、3.87、7.75、15.50、38.74、77.48μg·mL-1)从低浓度到高浓度依次进样20μL,记录色谱峰面积,以钠离子浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行二阶多项式回归得出回归方程:结果表明,钠离子进样浓度在1.94~77.48μg·mL-1(0.38%~15.5%)范围内呈二项式相关关系。3.1.3标准曲线及检测限精密量取对照品溶液(浓度为1.94μg·mL-1)0.5mL,置100mL量瓶中,加50%乙腈水溶液稀释至刻度,摇匀,用0.45μm滤膜滤过,取续滤液按上述色谱条件进样20μL,以S/N=3计,检测限为0.65μg·mL-1(0.13%);以S/N=10计,定量限为1.97μg·mL-1(0.39%)。3.1.4精密度3.1.4.钠离子含量测定取奥美拉唑钠样品细粉约12.5mg,精密称定,在2个实验室,用2台仪器,由2名实验人分别按“2.2”项和“2.3”项方法制备氯化钠对照品溶液以及供试品溶液,按“2.4”项下色谱条件及测定方法进行测定,计算钠离子平均含量(n=6)为6.23%,RSD为2.0%。3.1.4.钠离子含量取奥美拉唑钠样品细粉约12.5mg,精密称定,由同一实验人按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份,按“2.4”项下色谱条件及测定方法进行测定,计算钠离子含量的平均值(n=6)为6.22%,RSD为4.0%。3.1.5钠离子检测取奥美拉唑钠样品细粉约12.5mg,精密称定,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,室温静置,在上述条件下分别于0、4、8、12、16、24h依法进样20μL,记录钠离子峰面积的RSD(n=6)为5.0%,结果表明供试品溶液在24h内稳定,奥美拉唑可能出现的降解杂质峰并未干扰钠离子测定。3.1.6加样回收率试验采用加样回收率试验进行准确度测定。取已测知含量的样品细粉约12.5mg,精密称定,置25mL量瓶中,加50%乙腈水溶液5mL使溶解,分别精密加入钠离子浓度为412.3μg·mL-1的氯化钠对照品溶液0.5、1.0、2.5mL,分别相当于加入钠离子0.009、0.018、0.041mmol·L-1,用50%乙腈水溶液稀释至刻度,摇匀,每个浓度制备3份溶液,按“2.4”项下色谱条件及测定方法进行测定,计算加样回收率,结果低、中、高三浓度水平的平均加样回收率(n=3)分别为104.5%、101.7%、102.6%,RSD分别为1.3%、3.7%、2.2%。3.1.7色谱图的生成在HPLC方法开发过程中,分别调节流动相中缓冲液pH、有机相比例等色谱参数,均得到了类似的HPLC色谱图;在方法学验证中,由2名实验人在不同天分别用仪器A、仪器B以及Ⅰ号和Ⅱ号色谱柱进行实验,也得到了类似的HPLC色谱图,钠离子峰和氯离子峰分离良好,峰形正常,显示方法具有比较充分的色谱耐用性。3.1.8钠离子含量测定在完成HPLC方法开发以及方法学验证后,由2名实验员分别取奥美拉唑钠样品细粉约12.5mg,精密称定,分别按“2.2”项及“2.3”项下方法制备氯化钠对照品溶液以及供试品溶液,按“2.4”项下色谱条件及测定方法进行测定,计算供试品溶液中含钠离子的量,经SPSS19.0AVONA判定两人结果之间无显著差异(α=0.05),将两人结果平均,钠离子含量平均值(n=8)为6.23%,RSD为4.2%。3.2统计学方法分析方法通常以准确度以及精密度来衡量。按各国药典质量标准分析方法验证原则规定,对新建分析方法,需要进行充分方法验证以评价方法的适用性。然而,这些指导原则中并未具体规定方法学验证数据的可接受标准。随着化学计量学的发展,更多的数学统计模型用于分析方法验证结果的可靠性(reliability)研究,例如用多项式回归分析缩小测定范围以获得最小误差,用Bayesian概率研究评价不同浓度范围内分析结果的可靠性,用AVONA等统计学分析对方法学验证结果进行评价等等。这些统计方法能客观地评价分析方法数据的可靠性,保障了复杂生物样本以及生物分析的准确测定。根据文献报道,化学药物成盐时,51.4%以钠盐存在,38.6%以盐酸盐存在,因此,研究用HPLC-ELSD法测定化学药物成盐离子含量的准确性影响因素时,主要集中于对钠离子、氯离子含量的影响。在以往头孢曲松钠的钠离子含量测定研究中,方法精密度较低(RSD在2%~6%之间),推测可能与所用ELSD状态有关,还有可能是与受头孢曲松峰很难洗脱导致色谱柱选择性出现变化有关。因此,在实验方法设计时,选择奥美拉唑钠、头孢曲松钠、盐酸博宁霉素分别代表药物分子未保留、强保留和不洗脱3种洗脱状态,依次进行加样回收率、精密度试验,以数据统计软件SPSS19.0进行统计分析(t-检验、ANOVA等),以考察药物分子洗脱状态对成盐离子含量测定准确性的影响。3.2.1洗脱状态对准确度的影响方法准确度通常以加样回收率来表述,也可以与理论值比较。奥美拉唑钠理论上以一分子奥美拉唑与一分子钠成盐形式存在,其钠离子理论含量为6.24%,经分析,实测平均含量(n=8)为6.23%,RSD为4.2%,经数据统计软件SPSS19.0进行t-检验,无显著性差异(α=0.05),说明药物分子洗脱状态对准确度无影响。影响色谱方法精密度的常规因素包括分析仪器、色谱柱、人员操作、样品均匀性等几个方面,文中不再讨论,重点讨论以下因素。3.2.2elsd检测所导致的精密度ELSD检测器实际检测的是醋酸铵盐等可挥发性颗粒物质,颗粒的形成过程、大小、形状等均可能导致响应值的差异,在实验设计时,将HPLC-UV与ELSD串联,同一供试品溶液连续进样6次(进样重复性),分别计算UV色谱图中主成分峰以及ELSD色谱图中钠离子峰的峰面积RSD,以此值衡量ELSD检测器所导致的精密度影响。经测定,奥美拉唑钠中UV色谱图中奥美拉唑峰面积的RSD(n=6)为0.86%,而ELSD色谱图中钠离子峰面积的RSD(n=6)为2.8%,经ANOVA分析,ELSD检测器的进样重复性明显低于UV检测器(α=0.05)。3.2.3洗脱状态的影响为考察药物分子洗脱状态对成盐离子测定精密度的影响,在实验设计时,在同一段时间内、同一仪器、同一色谱柱、同一分析员进行测定尽量排除仪器、人员操作的影响;将样品研匀,缩短取样时间,尽量排除样品取样均匀性的影响;由此,根据误差分析思路,3个组(奥美拉唑钠、头孢曲松钠、盐酸博宁霉素)所得到的精密度(包括中间精密度、重复性)数据,能粗略地代表药物分子在色谱过程中未保留、强保留和不洗脱这3种洗脱状态下对钠离子、氯离子测定的影响。将奥美拉唑钠中钠离子测定的中间精密度结果(RSD为2.0%,n=6)与头孢曲松钠中的钠离子测定的中间精密度结果(RSD为4.3%,n=6)比较,经ANOVA分析,有显著差异(α=0.05);将奥美拉唑钠中钠离子