植物线粒体能量代谢与相关蛋白的研究进展

植物线粒体能量代谢与相关蛋白的研究进展

植物中轴线电子传播链有很多方法，包括主细胞色素路径和两条路径：抗氰反应路径和偶联联蛋白质路径。后两者与细胞色素主路途径中的复合体I、复合体III和复合体IV不同,不产生质子电化学势能。交替氧化酶介导的交替呼吸途径,对氰化物不敏感,可氧化泛醌,还原氧。而解偶联蛋白介导的解偶联呼吸途径,破坏H+电化学梯度(McDonald2008)。植物线粒体解偶联蛋白(plantuncouplingmitochondrialprotein,PUMP)和交替氧化酶(alternativeoxidase,AOX)具有相同的功能:减少ATP的合成,增加热能的释放(Vercesi等2006)。既然这两种能量耗散途径会影响细胞内的能量合成,因此应该存在一种机制来调控能量耗散和能量生成与线粒体中氧气的关系。诸多研究表明,PUMP和AOX可能在植物生热作用和维持细胞能量平衡中起作用(Vercesi等2006)。PUMP和AOX是共同调控,还是互补的关系,才能保证氧化磷酸化作用最有效率和维持植物细胞中能量平衡的呢?据此,本文介绍AOX和PUMP两条能量耗散途径在植物线粒体中的生理作用,并分析了两者在功能上的相关性。1同时，葡萄质酸氧化反应的结构和生理功能1.1aol代谢因子交替氧化酶(AOX)是植物线粒体呼吸链中抗氰呼吸途径(cyanide-resistantrespirationpathway)的末端氧化酶,它拥有2个跨膜螺旋,具有一个活性中心区域和一个泛醌接合区(Moore等2002)。AOX的活性位点包含一个不含血红素的双铁中心,因此称为双铁羧基蛋白(di-ironcarboxylateprotein)。最初的研究认为AOX蛋白分子量只有27kDa,后续的研究表明,AOX蛋白大小在32~39kDa之间。AOX蛋白由核基因编码,至少有两大基因家族编码AOX蛋白,AOX1和AOX2(Considine等2002)。AOX1家族存在于单子叶植物和双子叶植物中,而AOX2家族仅在双子叶植物中发现。最近,在拟南芥植物中还发现了AOX3家族(Borecky等2006)。AOX蛋白活性被SHAM(水杨基羟肟酸)和nPG(n-丙基没食子酸)抑制,而受α-酮酸(丙酮酸等)活化(Yip和Vanlerberghe2001)。另外,AOX的活性也会受其自身氧化还原状态调控,共价结合的二聚体(氧化态)的活性比单体(还原态)低(McDonald2008)。交替氧化酶广泛存在于高等植物及部分真菌和藻类中,据最新的研究报道认为AOX可能存在于除太古细菌以外的所有生物界中(McDonald和Vanlerberghe2006;McDonald2008)。AOX确定的功能是在天南星科白星海芋属植物佛焰花序开花时的呼吸产热(McDonald2008;Wagner等2008)。而对于AOX在非产热组织中的功能,长期以来“溢流”假说广泛得到接受(雷韬等2006)。在非产热性植物中,冷胁迫会诱导AOX的表达(Calegario等2003;Fung等2004;Lei等2008;Mizuno等2008)。此外,干旱(Bartoli等2005)、高盐(Costa等2007;Ferreira等2008)、高光照(Noguchi等2005)、营养缺乏(Sieger等2005)、机械伤害和化学物质(Vandenabeele等2003;Parani等2004;Castro-Guerrero等2008)等胁迫条件也会诱导AOX的大量表达。我们实验室的一些研究也证明冷害(Yan等2004)、渗透胁迫(He等1999)和病原体侵害(雷韬等2006)等胁迫均诱导AOX蛋白表达。总之,似乎一切能抑制或降低细胞色素途径能力的胁迫都会对交替氧化酶产生诱导作用(Moore等2002)。近年来,有关交替氧化酶在逆境胁迫下的研究表明,交替氧化酶具有清除活性氧(ROS)(Moller2001;Yip和Vanerberghe2001;Robson和Vanerberghe2002;Watanabe等2008)、抑制细胞凋亡(Ordog等2002;Vanlerberghe等2002)、稳定植物生长速率(Moore等2002;Hansen等2002)和增加植物抵御能力(Elhafez等2006;Fung等2006;Ederli等2006)等功能。另外,交替氧化酶也可在叶的发育和果实成熟等生理时期增强表达(Considine等2001;Holtzapffel等2002)。交替氧化酶还可能与光合作用有关(Bartoli等2005;Noguchi等2005;Feng等2007;Yoshida等2007)。1.2h+重吸收剂1995年,Vercesi等人首次在土豆块茎中发现了动物褐色脂肪组织UCP1的类似物,称为植物线粒体解偶联蛋白(PUMP),分子量大小为32kDa,具有6个跨膜区。随后,在土豆花和拟南芥植株中克隆出了PUMP基因。PUMP存在于很多种植物中,如番茄、菠菜、胡萝卜、花椰菜、椰菜和甘蓝等(Jezek等2000)。另外,在果实中也有,如香蕉、芒果、苹果、草莓、木瓜、柠檬、桔子、菠萝、梨和桃(Jezek等2000)。最新的研究认为,解偶联蛋白存在于除酵母以外的所有真核生物中(Borecky等2001a)。在植物线粒体中,解偶联蛋白作为线粒体阴离子载体蛋白(Haferkamp2007),可以通过自由脂肪酸循环将H+重新运回线粒体基质,该过程绕过ATP合成酶,破坏质子电化学势能,不产生ATP(Jarmuszkiewicz2001;Sluse和Jarmuszkiewicz2002)。这个过程也称为非偶联呼吸(Borecky和Vercesi2005)。不过,对于脂肪酸(FA)诱导的由PUMPs引起的H+重吸收机制来说,有两种不同的模型假说(图1):第一种是FA缓冲模型,FAs与UCP结合,并且其羧基端作为H+受体/供体与UCP上的羧基残基进行H+传递。在此过程中,FAs充当辅酶的功能,而UCP才是H+的运输载体。第二种是FA质子载体模型,H+通过FA循环运输,UCP的作用是将FA阴离子从线粒体基质运输到膜间腔,FA阴离子在膜间腔再次与H+结合,中性的FA靠“翻转机制”穿过线粒体内膜回到线粒体基质(Vercesi等2006)。诸多研究证明,FFA(自由脂肪酸,如亚油酸)可增强PUMP的活性(Borecky等2001b),但PUMP会受嘌呤核苷酸(如ATP、GTP)和BSA(牛血清蛋白)的抑制(Jezek等2000)。与交替氧化酶一样,PUMP也受冷胁迫的诱导。在植物中,拟南芥PUMP的编码基因AtPUMP1、AtPUMP4和AtPUMP5受冷胁迫诱导(Borecky等2006),马铃薯PUMP的编码基因StPUMP和甘蔗PUMP的编码基因SsPUMP4和SsPUMP5在冷胁迫下也会上升(Calegario等2003;Borecky等2006)。一直以来,小麦UCP基因常认为是不受冷胁迫诱导的(Murayama和Handa2000;Vercesi等2006),但最近的研究表明,小麦叶片UCP1(WhUCP1)的转录水平在低温下会大量积累(Mizuno等2008)。此外,PUMP还可能参与代谢产热和果实成熟(Considine等2001;Holtzapffel等2002),调节线粒体中活性氧的产生从而响应环境胁迫(Moller2001;Cheong等2002;vanWees等2003)和平衡细胞内的能量代谢(Sluse和Jarmuszkiewicz2002)。2分子氧代质系与植物染色体结构、生理和生理特征的关系植物交替氧化酶(AOX)和解偶联蛋白(PUMP)都有相同的功能:耗散自由能转变成热能,减少ATP的合成。但为什么会同时存在这两种不同的酶呢?其中有什么样的生理需求?这个问题也许可以从它们解偶联质子电化学势能的方式得到答案。交替氧化酶是连接于泛醌的一个分支,直接从泛醌获得电子传递给分子氧,因此不受质子梯度势能的调控。相反,PUMP直接降低跨线粒体内膜质子梯度势能。另一方面,根据交替氧化酶的动力学特征,只有当线粒体内具有相对较高泛醌还原水平时,AOX才会参与电子传递。而PUMP在相对较低的泛醌还原水平条件下也可以发挥作用,它能促进电子传递达到一个较高水平(Affourtit等2001)。关于交替氧化酶和解偶联蛋白在植物线粒体中的真实作用关系,有几种不同的观点。近年来的研究仍然是主要集中在果实成熟和逆境胁迫两大方面。特别是在果实成熟过程中交替氧化酶和解偶联蛋白的功能相关性研究是国际上的热点。2.1aol和pump协同作用的机制Sluse和Jarmuszkiewicz(2000)在研究采后番茄果实成熟过程中抗氰呼吸和非偶联呼吸时表明AOX蛋白及抗氰呼吸在番茄绿熟期就开始下降,而解偶联蛋白及非偶联呼吸在番茄黄色期才开始下降,从而说明两种蛋白在果实成熟过程中起不同的作用。他们认为,果实成熟过程中内源FFA(自由脂肪酸)会逐渐上升,FFA促进PUMP的活性而抑制AOX的活性,因此PUMP和AOX不会同时处于最佳活性状态,两者在果实成熟过程中的功能应该是相继发挥的。AOX可能主要是在果实生长期为细胞提供一系列的平衡,如氧化还原势能平衡、磷酸化势能平衡及生物合成的供求平衡等。相反,PUMP可能是在果实内FFA浓度上升到一定水平时才开始发挥作用,起产热、降低氧化磷酸化效率和终止细胞内生物合成等作用。但是有人在研究芒果果实成熟期间交替氧化酶和解偶联蛋白表达变化情况时却发现与番茄中不同的现象。AOX和PUMP都是随着果实成熟而呈上升趋势,PUMP表达量在转熟期达到峰值,AOX表达量在完熟期达到峰值。两者在成熟过程中同时被激活,同时起作用(Considine等2001)。番茄和芒果同属于呼吸跃变型果实,结果却截然相反,这是由于它们有一个不同的成熟变化过程吗?番茄果实成熟期间FFA会逐渐上升,芒果成熟期间FFA也上升。如果番茄果实中由于FFA对AOX的负调节效应而导致AOX和PUMP在成熟期间呈相继表达,那么芒果中逐渐上升的FFA对AOX和PUMP又起什么作用呢?根据已有的研究结果,我们推测植物线粒体交替氧化酶和解偶联蛋白在果实成熟过程中应该是同时受诱导表达,两者呈互补关系。交替氧化酶和解偶联蛋白存在于线粒体电子传递链上的两条不同的支路上,前者从还原态泛醌处得电子传递给氧,可以避免泛醌呈过饱和状态而形成氧自由基,后者破坏跨线粒体内膜质子梯度势能,可保证细胞在高能状态下的电子传递。正是两者的协同作用才稳定了细胞内的能量平衡。对于在番茄和芒果中出现的不同的现象,我们更倾向于赞同Considine等(2001)在芒果中的研究结果。由于Sluse和Jarmuszkiewicz(2000)是通过测定分离后的线粒体中蛋白活性推测蛋白间的相互关系的,所以证据显得不足。Holtzapffel等(2002)以活体番茄为材料研究番茄成熟时期蛋白表达变化的结果表明,在果实成熟期间AOX和PUMP的表达是上升的。最近,我们在研究番茄果实成熟过程中抗氰呼吸与果实成熟的关系时发现,当抑制抗氰呼吸时,乙烯合成基因和受体基因的表达会降低,呼吸跃变和果实成熟会延缓(未发表资料)。从而可以推测,交替氧化酶参与呼吸跃变和果实成熟,同时应该还有其他物质(如PUMP)与呼吸跃变和果实成熟有关,与交替氧化酶形成互补关系,共同调节呼吸跃变和果实成熟。2.2AOX和PUMP在增强植物抵御逆境胁迫中的相互关系其实,有关AOX和PUMP增强植物抵御逆境胁迫的研究已有较多报道(Moller2001;Fung等2006)。生物和非生物胁迫都会诱导植物体内AOX和PUMP表达量上升,这主要是因为环境胁迫会导致植物体内活性氧(ROS)的上升及破坏细胞内的代谢平衡,而AOX和PUMP均被认为可以减少活性氧的产生(Maxwell等2002;Malgorzata和Wieslawa2005;Borecky等2006),维持细胞内的代谢平衡(Sluse和Jarmuszkiewicz2000)。ROS作为一种信号分子,对AOX和PUMP具有正调控作用。最近几年的研究表明,低温、干旱、伤、渗透胁迫等引起细胞内产生氧化胁迫,AOX和PUMP共同参与形成抗氧化防御体系,保护植物线粒体免受氧化损伤,维持植物细胞中的能量平衡(Borecky等2006;Armstrong等2008)。这种保护机制在于,AOX作为连接于泛醌的一条支路,可以利用电子传递链上过多的电子,阻止呼吸链过氧化(McDonald2008)。而PUMP则直接破坏∆Ψm(跨线粒体内膜梯度势能),可避免高∆Ψm形成过氧化物,并调节∆Ψm使之处于氧化磷酸化作用的最优状态(Vercesi等2006)。2.3pump的表达交替氧化酶和解偶联蛋白均证明存在于植物产热组织中(Ito和Seymour2005)。AOX业已确定的功能是在植物开花时期的呼吸产热,并且认为在植物产热作用中起主要作用。而PUMP在产热组织中的功能尚不清楚。Vercesi等(2006)认为PUMP在植物线粒体中的表达量还不足以引起产热作用的发生。不过,新近有关PUMP在植物产热组织中的研究有了较大突破。在臭菘肉穗花序中发现AOX和PUMP可能在产热组织和产热时期共同表达,臭菘解偶联蛋白(SrUCP)在产热作用发生过程中扮演着重要角色(Ito-Inaba等2008)。同时,Onda等(2008)研究臭菘肉穗花序产热调控表明,LA(亚油酸)抑制AOX的同时丙酮酸又会促进AOX。也就是说,丙酮酸对AOX的活化作用可以抵消LA对其的抑制作用。因此,AOX和PUMP可以在臭菘肉穗花序产热过程中共表达。3aol和pump基因家族在环境胁迫下的表达交替氧化酶和解偶联蛋白的结构和功能虽已有大量报道,但关于AOX和PUMP在植物能量代谢中的作用,还有待进一步研究。交替氧化酶和解偶联蛋白在生物和非生物胁迫中具有相似的功效:减少活性氧的产生,增加植物抗性,维持细胞内的能量平衡。因此,了解它们的功能相关性,解开它们共存之谜应该是今后研究的重点。特别是在果实成熟过程中,两者的作用仍存在较大的分歧。虽然果实成熟过程中不断上升FFA对AOX有抑制作用而对PUMP具有促进作用,但AOX和PUMP不仅仅是受FFA单一因子的调控,嘌呤核苷酸会抑制FFA对PUMP的促进作用,酮酸会促进AOX的表达。在