柴胡疏肝散对肝气郁结证模型大鼠尿液代谢组学的影响

柴胡疏肝散对肝气郁结证模型大鼠尿液代谢组学的影响

肝气郁结证是中医临床常见病。几十年来，中医对肝气郁结证的本质进行了研究。其生物学基础一直是研究的重点，但肝气郁结证不能整体研究。我们运用代谢组学技术,从整体上研究肝气郁结证模型大鼠尿液代谢组学变化及柴胡疏肝散对它们的影响。1材料和方法1.1自由饮水,国内饮水30只SD大鼠,由华中科技大学动物实验中心提供,清洁级,雄性,体重为(220±28)g,自由饮水进食。30只大鼠随机分为3组:正常组10只(A组)、模型组10只(B组)和给药组10只(C组),正常组和模型组大鼠每天按10ml/kg生理盐水灌胃,给药组大鼠每天按10ml/kg柴胡疏肝散水煎液灌胃。1.2仪器和检测仪器重水(D2O)由中国科学院物理与数学研究所进口分装,三甲基硅烷基丙酸(TSP)为加拿大默克公司产品;K2HPO4,NaH2PO4,Na2HPO4,叠氮钠为上海生工生物工程有限公司产品;AVANCE400M型超导傅立叶变换核磁共振波谱仪(NMR)为德国布鲁克公司产品。离心机为德国EppendorfMinispinPIUS产品;低速台式离心机TDZ4B-WS为赛特湘离心机仪器公司产品;数控超声波清洗器KQ-100DV为昆山超声仪器有限公司产品;液氮罐YDS(扬州广陵化玻公司),移液器(德国Eppendorf),5mm核磁管(美国BD公司),电子天平DT500(常熟市百灵天平仪器有限公司)。1.3止血钳夹鼠的成网造模方法参照须惠仁等的方法建立,模型组与给药组大鼠分别置于同笼,用纱布包裹尖端的止血钳夹鼠尾巴,因为疼痛,与其他大鼠撕打会很快激怒全笼的大鼠。夹尾每次刺激30分钟,每隔3小时1次,每天刺激4次,每天轮换刺激不同大鼠,激怒刺激10天后进行实验指标检测。1.4大鼠尿标本制备分别于造模开始前1天和第10天用代谢笼收集24小时尿液。分别收集正常组、模型组、给药组大鼠尿液标本3ml,室温下,存于接尿管(内加500μl浓度为1mmol/L叠氮钠)中,接尿管置于冰中保持低温,新鲜尿液离心温度20℃,7000rpm,离心10分钟,去除固体杂质。用EP管收集上层2ml尿液,离心后分装置于-76℃冰箱保存备用。1.5待测溶液的配制尿液标本常温解冻后,从每份尿液向编号后的离心管中分别依次加入400μl尿液,加入188μl磷酸盐/D2Obuffer(0.2ml)、Na2HPO4(0.0116g)、NaH2PO4(0.0012g)、TSP(0.0001g),pH7.4,并加TSP10μl为内标(MTSP=1×10-3mol/L)配成待测溶液。充分震荡混匀后,样品静置10分钟再于4℃、13000rpm低温离心10分钟,取上层清液550μl置于5mm核磁管中,准备进行AVANCE400M型超导傅立叶变换NMR测试。1.6预处理nmr谱图在超导傅立叶变换NMR上调用相关NOESY谱脉冲序列,设置参数,然后进行采样,得到自由感应衰减(FID)信号。设置主要参数:预饱和方式抑制水峰,预饱和时间(satdly)为2秒,预饱和功率(satpwr)为2,扫描谱宽(swh)为9615Hz,采样数据点数(np)为65536(64k),累加次数(ns)为128,然后开始采样,得到FID信号。谱图处理:将得到的FID信号通过32k傅立叶变换及校正相位和基线等转换为1H-NMR谱,得到3组大鼠在造模前1天、第10天不同时间点的尿液代谢产物1H-NMR谱图。分段积分:以TSP为化学位移参考峰的位置,设为0ppm,调用NMR中的程序将1H谱按默认值,从9.5m到0.05m,每段为0.04ppm,进行分段积分。为了避开水峰对谱图造成的影响,水峰附近的区域(4.2~5.2)将被去除,最后将积分数据按样品编号、时间编号用Excel文件储存,以便进行NMR数据数字化处理。将积分数据归一化后,保存,以备主成分分析(prineipalcomponentsanalysis,PCA)时使用。1.7大鼠阴道代谢组分的分析方法主成分分析法(PCA)分析。将积分值进行中心化和比例换算,用SIMCA-P10.0软件包(瑞典,UmetricsAB,Umea)进行多变量统计学分析,用PCA求出主成分(principalcompo-nents,PC),利用PC对各组大鼠尿液的代谢组分进行分析。2结果2.1地u业已来也活模型组大鼠毛发稀松,行动迟缓,活动量减少,不活泼,大便次数增多,色浅、松散而特臭,性情烦躁,容易激惹,叫声尖细,胡须凌乱;而正常组大鼠毛发光泽,行动快捷,饮食、大便均正常。2.21造模前后大鼠的考虑图1为3组大鼠尿液典型的1H-NMR谱,可以看出正常组与模型组之间1H-NMR谱有明显差别,说明造模后大鼠的内源性代谢谱发生了明显的变化,模型组与给药组之间1H-NMR谱有明显差别,说明经给药后大鼠的尿液代谢谱发生了变化,可以初步判断大鼠给药前后尿液组成的成分和比例上有明显的变化。2.3模型大鼠尿酸及肌酸含量的变化对1H-NMR谱峰积分值进行PCA分析后,得到PCA得分图。正常组与模型组PCA有明显区别,可见标本的PC积分值分别集中分布于椭圆形散点图(95%的置信区域内)的4个区域中,两组均能互相区分开来,并且互不重叠,说明两组的代谢表型有差异(图2);模型组与给药组区分明显(图3),互不重叠;正常组与给药组没有显著差异(图4)。对1H-NMR谱峰积分值进行PCA分析后,得到因子载荷图,从两两比较的PCA因子载荷图(图5、图6)可见,少数点远离原点,大多数点集中在原点附近,正是这些远离原点的化学位移所代表的化合物造成了各组间差异。对PC1及PC2的进一步分析,并对其主要代谢物组的1H-NMR谱化学位移进行归属。对1H-NMR谱化学位移进行归属,通过谱库验证,根据原始图谱的信号峰和判别分析因子载荷图的贡献度,共同分析得出其浓度的组间差异,以上数据表明:与正常组相比,模型组大鼠尿液马尿酸3.97、7.55、7.85,α-酮戊二酸3.01、2.45,柠檬酸2.57、4.10、2.88,异柠檬酸3.99、2.51、2.43和乌头酸3.77、6.96、3.96的谱峰相对积分面积明显减少,在尿液中含量降低;肌酸酐3.05、4.07,丙酮2.23,乙酸1.93,肌酸3.93、3.03,烟酸4.41、1.41和5-羟基吲哚-3-乙酸3.03、2.91、6.63、7.15的谱峰相对积分面积明显增高,在尿液中的含量显著升高。给予柴胡疏肝散灌胃干预后,给药组大鼠尿液肌酸3.93、3.03,丙酮2.23,肌酸酐3.05等含量明显下降;N-氧化三甲胺、TMAO、牛磺酸等含量明显增高,其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势,呈现代谢网络修复的结果。3中药在脏器代谢中的应用机体正常的生理状态是靠各代谢途径之间相互制约而形成的网络系统维持的,疾病状态可以看成是正常生理平衡被打破、超过机体自身调节能力范围的一种非平衡状态,药物的使用就是要使这种失衡状态回复到原始的平衡状态或达到一个新的平衡。疾病是一组生化指标经过系统分析后的偏离常态,单靠传统的、孤立、片面的几个临床指标已不能准确、全面、整体地反映疾病内在变化和满足对疾病诊治的要求。利用不同性质代谢物之间的相互偶联关系和与生理、病理状态的联系对有效区分生理、病理状态,彻底阐述疾病的机理,合理利用药物通过代谢干预达到诊治疾病的目的都具有十分重要的意义。肝气郁结证本质研究,一直是中西医结合研究领域的热点之一。数十年来,对设想可能成为肝气郁结证本质的许多物质如激素、cAMP、cGMP、神经递质、微量元素等进行了大量研究,仅观察到与肝气郁结证本质有关的现象和事实,但未能明确阐释肝气郁结证的实质。目前,在研究中仍然存在着选取的一般指标项目较多,而特异性、敏感性均高的指标相对较少的现状,其中不少指标在不同证型之间有类似的改变,因而临床无鉴别价值。代谢组学是近年迅速发展起来的新兴生命学科,它从代谢的角度研究生命的本质及疾病的发生、发展过程。它把人体作为一个完整的系统来研究,研究人体代谢网络在疾病和药物作用下的变化规律,与中医中药整体观点的哲学思想十分吻合