中国杜鹃属植物根部真菌多样性初步研究

中国杜鹃属植物根部真菌多样性初步研究

60%以上的世界杜鹃是中国的特产，尤其是分布在中国云南、四川和西藏的高山多年生杜鹃。许多品种是中国独特的。它们是高山区生态系统中的建群种或伴生种,具有重要的生态价值。杜鹃花科植物分布广泛,其根系普遍能与真菌形成一类特殊的菌根——杜鹃花类菌根,也称欧石楠菌根(ericoidmycorrhizae,ERM)。近几年,人们对杜鹃花类菌根的生物学和生态功能的研究越来越重视。研究表明菌根真菌的侵染对杜鹃花科植物的生长发育是有益的(Pearson&Read,1973)。一些杜鹃花类菌根真菌具有腐生营养能力,并能降解难以分解的物质,而且能在许多方面提高植物的适应性,如改善氮的吸收,提高对有毒金属的抗性和土壤解毒能力(Cairney&Ashford,2002;Cairney&Meharg,2003)。另外,杜鹃花科植物的根系没有根毛,吸收能力比具有根毛的根系小得多,杜鹃花科植物通过根系与真菌形成菌根(Smith&Read,1997),增强了对水分及营养的吸收能力(Lereau,1985)。人们早期发现的能和杜鹃花科植物形成杜鹃花类菌根的真菌都属于子囊菌纲,包括柔膜菌目的真菌Rhizoscyphusericae(=Hymenoscyphusericae)(Zhang&Zhuang,2004)和它的无性阶段Scytalidiumvaccinii(Pearson&Read,1973;Egger&Sigler,1993;Hambleton&Currah,1997),以及典型的杜鹃花类菌根真菌树粉孢属(Oidiodendron)真菌(Perottoetal.,1995,1996;Hambleton&Currah,1997;Monrealetal.,1999)。随着分子技术的应用,人们开始利用rDNA序列研究内生真菌的遗传多样性和分类学地位,对杜鹃花类菌根真菌种类的认识越来越深入。例如,Bougoure和Cairney(2005)分离培养了澳大利亚的杜鹃花属植物Rhododendronlochiae根部的菌根真菌,利用限制性片段多态性(RFLPs)和ITS序列及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析,通过比较直接提取得到的DNA的真菌ITS序列和分离培养得到的真菌集合,最终得到了一系列杜鹃花类菌根真菌和非菌根真菌。我国西南是杜鹃花类植物分布中心,全面开展杜鹃花类植物菌根真菌多样性研究,必将有助于理解植物与真菌共生关系对环境的适应及生物多样性维持机制。为此,我们在四川省的中国杜鹃园选取两种杜鹃花植物,采用直接扩增其根部真菌rDNA-ITS等分子手段研究了杜鹃花属植物根部真菌的多样性。1材料和方法1.1都江堰市创新生态地区的自然旅游资源实验地点设在四川省的中国杜鹃园(30°44′00′′N,103°27′00′′E),海拔1,700–1,800m,位于川西平原向青藏高原过渡地带的都江堰市西北30km的龙池地区,处在三面环山的马蹄形山间盆地内。成土母质为花岗岩,土壤为山地黄棕壤,气候属中亚热带湿润性季风气候。实验地年平均气温8℃,年降雨量1,600–2,000mm。1.2发根、含土块的发根分别随机选取3株树龄约20年的银叶杜鹃(Rhododendronargyrophyllum)和繁花杜鹃(R.floribundum),找到最细的发根(hairroots)部分,在不同的位置上用枝剪小心剪下。将取到的发根同附着的土块在水中浸泡约1h,用水小心冲洗干净。将发根剪成约1cm长的根段,每种杜鹃花随机取10个根段,分别放入100%的酒精中保存用于DNA提取。1.3pcr扩增和克隆采用改良的CTAB法(Guoetal.,2000),分别提取每个根段的基因组DNA进行检测。采用巢式PCR的方法扩增真菌的内转录区(ITS),所用引物为内外两对引物。第一轮ITS-PCR扩增引物为NSI1(5′-GATTGAATGGCTTAGTG-AGG-3′)和NLB4(5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-C-3′)(Martin&Rygiewicz,2005)。PCR反应体系为50µL,含有2.0mMMgCl2,0.2mMdNTP(TaKaRaJapan),0.2µM引物,25mgBSA,2UTaq聚合酶(TaKaRa,Japan)和适量的模板DNA,加入去离子水补足至50µL。PCR反应程序:95℃预变性8min95℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸40s,共35个循环;最后72℃延伸5min。反应过程中用去离子水做阴性对照。第二轮ITS-PCR扩增引物为ITS1-F(5′-CTTGG-TCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3′)(Grades&Bruns,1993)。PCR反应体系为25µL,含有1.5mMMgCl2,0.2mMdNTP(TaKaRa,Japan),0.2µM引物,1.5UTaq聚合酶(TaKaRa,Japan),1µL第一轮ITS-PCR产物作为模板DNA,加入去离子水补足至25µL。PCR反应程序:94℃预变性5min,94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸55s,共30个循环;最后72℃延伸10min。引物序列由上海生物工程有限公司合成。ITS-PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳,用凝胶成像仪观察。参考Renker等(2006)混合PCR产物克隆的方法将每种杜鹃花的10个ITS-PCR产物混合作为外源DNA,使用pEASY-T3CloningVector(TransGeneBiotech,China)进行克隆,用TOP10感受态细胞(TransGeneBiotech,China)进行转化。从每一个克隆库中随机挑取100个克隆。每一个阳性克隆用引物ITS1-F和ITS4扩增ITS区域,将得到的ITS-PCR产物依次用限制性内切酶HinfI和AluI(TaKaRa,Japan)分别进行酶切。酶切片段在2%的琼脂糖凝胶上电泳检测,用凝胶成像系统记录谱带图像。挑选具有特异性的RFLP带型的PCR产物进行ITS序列测定,测序由Invitrogen生物技术有限公司完成。1.4在真菌范围内分析1.5种真菌间克隆数目的差异显著性检验用Fisher’sExactTest(Clarksonetal.,1993)检验两种真菌种类间克隆数目的差异,0.05作为差异显著性检验的域值。2结果2.1水景菌纲类型银叶杜鹃和繁花杜鹃的两个克隆库中,共得到197个克隆,其中92个来自于银叶杜鹃根部,105个来自繁花杜鹃根部。经过RFLP分析及测序,得到89个具有特异性RFLP带型的克隆序列。相似度≥97%的序列被视为同一个分类单元,共得到41个真菌分类单元(表1)。其中24个属于担子菌纲,分别属于:蜡壳耳目(Sebacinales)、伞菌目(Agaricales)、Erythrobasidiales和线黑粉菌目(Filobasidiales)4个目,17个属于子囊菌纲真菌,分别属于柔膜菌目(Helotiales)、散囊菌目(Eurotiales)、盘菌目(Pezizales)和假球壳目(Pleosporales)。通过与GenBank数据库中的序列对比分析,发现所得到克隆中有40个为曾经报道过的典型的杜鹃花类菌根真菌,占比例较大。其中有30个与子囊菌纲柔膜菌目的真菌R.ericae(AY394687,AM084704和AY394684)具有较高的相似度,9个与树粉孢属(Oidiodendron,Myxotrichaceae)真菌具有较高的相似度,1个与Cryptosporiopsis(皮盘菌科,Dermateaceae)真菌最相近。另外10个克隆与未能培养的杜鹃花菌根真菌AB089663和AB089660(Usuketal.,2003)以及在沙龙树(Gaultheriashallon)根部得到的真菌AF300726(Allenetal.,2003)比对具有较高的相似度,这些都是曾报道过的分离于杜鹃花科植物根部但未能定名的真菌。在得到的其他子囊菌纲克隆中,有14个属于青霉属(Penicillium)真菌1个属于拟青霉属(Paecilomyces)真菌,这两类真菌都属于腐生营养的子囊菌纲种类。在本研究中分离得到的担子菌纲真菌克隆也占有显著的比例。共有41个克隆属于蜡壳耳目,24个与伞菌目的口蘑科(Tricholomataceae)真菌最相近,还有一些克隆与Erythrobasidiales和线黑粉菌目的真菌具有较高的相似度。总之,在两种杜鹃的根部系统中,存在丰富多样的真菌群落,包括典型的杜鹃花类菌根真菌、外生菌根真菌和一些其他类型真菌。2.2银叶植物erythrobasiwelle的真菌克隆银叶杜鹃和繁花杜鹃根部中出现的真菌主要类群相似。从表2可以看出,在银叶杜鹃根部系统中,出现相对频率最高的前3类真菌克隆属于柔膜菌目、散囊菌目和蜡壳耳目;在繁花杜鹃根部系统中,出现相对频率最高的前3类真菌克隆属于伞菌目、蜡壳耳目和柔膜菌目。另外,在银叶杜鹃和繁花杜鹃根部出现的不同真菌种类的相对频率也不同(图1)。经Fisher’sExacTest检验,银叶杜鹃根部的青霉属、树粉孢属和担孢酵母属(Erythrobasidium)真菌的克隆,其相对频率都极显著高于繁花杜鹃(P<0.01)。而在繁花杜鹃中的伞菌目真菌的克隆相对频率极显著高于银叶杜鹃中的克隆相对频率(P<0.01)。3讨论3.1蜡壳耳目真菌的分离和鉴定通过序列比对,我们发现子囊菌纲柔膜菌目的真菌种类在两种杜鹃花根部中出现的相对频率很高(表2)。且柔膜菌目物种很多,包括许多已经报道过的杜鹃花类菌根真菌(Monrealetal.,1999;Berchetal.,2002;Vralstadetal.,2002)。其中R.ericaeaggregate和树粉孢属的Oidiodendronmaius分布最广泛,也是被研究最多的杜鹃花类菌根真菌(Read1996;Straker,1996;Smith&Read,1997)。在本研究中,树粉孢属真菌出现的相对频率较低,只出现在银叶杜鹃中(图1),而R.ericaeaggregate在两种杜鹃花中出现的相对频率都较高(图1)。这一结果与在荷兰和丹麦欧石楠荒野中生长的Callunavulgaris的根部真菌种类比例相似(Johansson,2001;Zijlstraetal.2005),他们分离得到的树粉孢属O.maius的频率较低。然而,Usuki等(2003)在对日本赤松林(Pinusdensiflora)中生长的R.obtusumvar.kaempferi菌根的研究中,分离得到的树粉孢属真菌O.maius频率却很高。Sigler等(2005)报道,在美国西北部的杜鹃花科植物中出现了柔膜菌目的真菌Cryptospo-riopsisericae,Zijlstra等(2005)从杜鹃花科植物根部分离的Cryptosporiopsis种类占8%,而本研究中我们只在银叶杜鹃中得到1个与C.ericae相似度达88.1%的克隆(表1),可以推断它至少应为柔膜菌目的真菌。本研究结果表明蜡壳耳目真菌也是存在于银叶杜鹃和繁花杜鹃根部的真菌(表2)。Weiss等(2004)曾通过系统发育分析将分离得到的蜡壳耳目真菌分为两大分支,即CladeA和CladeB,主要区别在于它们的生态功能不同,CladeA形成EEM(ectendomycorrhizas),CladeB形成杜鹃花类菌根。Setaro等(2006)使用分子鉴定方法和超显微结构分析,发现在厄瓜多尔南部生长的Cavendishianobilis根部的主要菌根真菌都属于蜡壳耳目。本研究中得到的蜡壳耳目克隆与Selosse等(2007)在火红杜鹃(Rhododendronneriiflorum)以及Epipactisplautris根部分离得到的蜡壳耳目真菌相似,而且这些真菌都属于蜡壳耳目的CladeB。Selosse等(2007)研究表明,蜡壳耳目真菌是杜鹃花科植物常见的菌根真菌,从杜鹃花类菌根中分离得到的真菌序列,都聚集在CladeB中。虽然分支B中的蜡壳耳目真菌可能是杜鹃花根部重要的菌根真菌,但是仍然需要回接实验来证明杜鹃花属植物和蜡壳耳目真菌的共生关系。Zhang等(2009)发现云锦杜鹃(R.fortunei)菌根分离菌主要仍是子囊菌纲真菌,很少量属于担子菌纲,其中有一种担子菌纲真菌可以通过回接实验在云锦杜鹃的表皮细胞中形成菌丝卷状的结构。由此看出部分杜鹃花类真菌,尤其是担子菌纲真菌不容易通过分离培养获得,但却可以在直接提取毛根DNA时被发现。3.2外生菌根真菌和说本研究结果显示银叶杜鹃和繁花杜鹃的根部有典型的外生菌根真菌存在,其中伞菌目真菌在繁花杜鹃中占显著优势(表2),包括口蘑属真菌和被命名为未培养的外生菌根真菌(AY641466)(表1)。另外,蜡壳耳目真菌也能广泛地与外生菌根植物形成外生菌根。在以前的研究中,人们认为外生菌根真菌和杜鹃花类菌根真菌属于不同的类群(Smith&Read,1997),然而这种观念在渐渐转变。吴重华(2000)报道了在太白山自然保护区巴山冷杉下采到的与金背杜鹃(R.clementiae)共生的3种真菌:卷缘网褶菌(Paxillusinvolotes)、亚褐环粘盖牛肝(Suillussubluteus)和黄粉牛肝菌(Pulverobololetusravenelii),这3种真菌都与金背杜鹃形成外生菌根。杜鹃花植物能与外生菌根真菌形成共生关系的生态学意义可能在于:常处于林下层的杜鹃花类植物,通过与外生菌根植物共生的同一种真菌菌丝体整合到森林的公共菌丝体网络,从而成为森林内部以公共菌丝体网络为中介的资源再分配活动的参与者。这可能对于它们适应多样的生境具有较重要意义。3.3资产阶段发生的变化本研究中,发现了拟青霉属与青霉属的真菌(表1),这两个属的真菌广泛存在于土壤、腐殖质中属于典型的腐生真菌。Bougoure等(2007)研究报道在苏格兰生长的杜鹃花科植物的根部也发现有Penicilli