木豆叶总黄酮对大鼠股骨头坏死的治疗作用及机制研究

木豆叶总黄酮对大鼠股骨头坏死的治疗作用及机制研究

股骨头坏死是一种慢性和退行性骨科疾病，通常发生在30年至50岁的年轻人。本病病程长,致残率高,不仅严重影响患者生存、生活质量和自身的工作能力,也给家庭和社会增添了沉重的负担。保髋手术治疗存在技术难度高、风险大、康复期长、经济负担重、疗效争议大等诸多问题;人工关节置换术则因关节材料和患者年龄的限制,5年失败率较高。中药治疗在减轻疼痛、改善功能等方面具有不可取代的优势,但存在复方应用、成分复杂、生物利用度低、起效慢而影响疗效等问题,成为中药在治疗推广上的瓶颈。因此,本研究依据我国国情,研究木豆叶总黄酮局部注射治疗股骨头坏死的作用与机制,寻找安全、高效、价廉与康复期短的股骨头坏死治疗新途径、新药物,有着深远的社会意义和重要的学术价值。1材料和方法1.1hmias-2000型调度机清洁级SD大鼠60只,购于河南省实验动物中心,许可证号:SCXK(豫)2005-0001,雌雄各半,体重(200±20)g。X光机:法国通用电气医疗系统,Senographe700T,SFDA(I)20013300672;MRI:德国,SIMENES3.0T,SFDA(I)20053283274;HMIAS-2000型高清晰病理图像分析系统:上海同济;Leica3000型恒冷冰冻切片机:德国。血管内皮生长因子(VEGF)(BA0407)免疫组化试剂盒,武汉博士德生物技术有限公司。1.2小鼠骨髓炎经皮将大鼠随机分为6组,每组10只:A组:假手术组;B组:模型对照组;C组:阳性药对照组;D组:木豆叶总黄酮高剂量组;E组:木豆叶总黄酮中剂量组;F组:木豆叶总黄酮低剂量组。医用水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉,俯卧位绑定于手术台,备皮、消毒,纵切口,依次切开皮肤,分离肌肉,暴露关节囊及股骨头,将股骨头半脱出髋臼,以无菌纱布保护周围组织,除A组外,其他组均快速用液氮罐内的金属棒点击股骨头前侧,反复10次,每次20s,温生理盐水复温。左侧造模。术后连续注射青霉素3d预防感染。A组每日注射0.2ml生理盐水;B组每日注射0.2ml生理盐水;C组每日注射复方香丹注射液0.1ml/300g体重(按成人用量换算10倍用药量);D、E、F组分别每日注射80,40,20mg·kg-1木豆叶总黄酮。均为左髋部肌肉注射。分别于用药第4周拍片后处死大鼠,取出左侧股骨头,观察外形及沿股骨头冠状面剖开,进行HE染色、VEGF免疫组化观察。观察股骨头坏死、修复、血运情况。2结果2.1模型成功组的骨纹理单纯液氮冷冻单侧造模因损伤小而生命指征完好,股骨头坏死表现在术后一周之后渐进,两周后X光片均出现“新月征”(如图1),以此确定模型成功。4周后X线片检查示A组大鼠骨纹理未见异常,B组大鼠骨纹理稀疏加重,新月征更明显(图2);C组和F组中各有4只大鼠骨纹理明显增多,新月征范围减少(图3),而E组中有6只大鼠、D组中有8只大鼠骨纹理明显增多、清晰,新月征范围减少,D组甚至有1只由新月征改为囊性改变(图4)。2.2骨小梁周沿生长规律A组:骨小梁整齐,排列规则,致密饱满,骨小梁的骨陷窝内中骨细胞清晰可见,核较大,位于细胞中央,偶可见骨陷窝空虚,骨小梁周沿成骨细胞数量多(图5a)。B组:骨小梁稀疏,变细,甚至有断裂现象,结构紊乱,甚至有碎片出现,骨皮质及骨小梁中骨细胞坏死,空骨陷窝明显增多,有明显大的脂肪滴,骨小梁周沿稍可见梭形,成骨细胞排列,呈梭形,但数量很少,骨小梁周沿未见明显新骨沉积性生长(图5b)。中药与阳性药物组好转,C组和F组各有4只大鼠出现骨小梁增多、变粗,碎片吸收,成骨细胞增多等病理改变,而E组中有6只大鼠出现坏死骨修复病理改变,D组10只大鼠均出现坏死骨修复病理改变,其中6只的病理改变非常明显(典型表现见图5c、5d、5e、5f)。2.3各组vegf表达情况的比较A组:假手术组,可见血管壁及其周围VEGF阳性表达细胞,表达物主要分布在细胞浆内,被染成黄褐色,其数量比较多(图6a)。B组:模型组,VEGF表达明显的下调,阳性表达细胞数量少(图6b)。C组:阳性药对照组和D、E、F木豆叶总黄酮各剂量组:在血管壁及其周围可见VEGF阳性表达细胞,其数量比模型组多,比正常组少。典型表现见图6。3模型制备与观察股骨头缺血坏死(ANFH)是骨科领域较为棘手的难题之一,其病理过程复杂,国内外学者对ANFH动物模型的建立进行了许多研究,到目前为止仍无一种理想的模型适合于ANFH的研究之用。其原因主要是难以模拟出人ANFH的自然病理过程和人ANFH软骨下骨塌陷的临床特征。依据“理想的模型应能够模拟人临床进展过程,即从早期的组织学改变到晚期的股骨头塌陷”原则,本试验过程中曾分别用激素、酒精和液氮冷冻造模,结果发现选用液氮冷冻造模快、成功率高、死亡率小,并且能够形成缺血的病理机制。预试时,改进手术入路,并分别用单纯液氮冷冻单侧造模、手术破坏+液氮冷冻单侧造模、液氮冷冻双侧造模、双侧手术破坏+液氮冷冻造模进行模型制备,术后连续观察生命指征、行为学特征与动态X光片。经比较发现:单纯液氮冷冻单侧造模因损伤小而生命指征完好,股骨头坏死表现在术后一周之后渐进,X光片出现“新月征”。随病理改变时间发展而发展,直至最后塌陷。表明液氮冷冻造模成功率高、死亡率小,能够模拟人的病理表现,是一种经济、实用的模型。木豆叶总黄酮治疗股骨头坏死为项目组顾问袁浩教授的专利处方,并获国家新药证书。研究中发现木豆叶总黄酮具有活血补肾的功效,其活血以通络,采用该药局部注射在坏死的股骨头内,一为通则不痛直接缓解症状,二为络脉通则瘀阻去,祛瘀以生新,股骨头得以精血濡养,养精髓壮则筋骨得养以达功效。本实验中木豆叶总黄酮高、中、低剂量治疗组在X线片及HE染色图片中,坏死股骨头骨修复及新骨形成等改变均较单纯手术对照组及模型对照组明显,而木豆叶总黄酮中、高剂量组优于阳性药物对照组且高剂量组改变又优于中剂量组,VEGF免疫组化染色各组标本观察指标中木豆叶总黄酮高剂量组新生血管最多,其次为中剂量组,阳性药物对照组和低剂