灵芝液体发酵天然培养基响应面优化研究

摘要灵芝是我国医药宝库中一种珍贵滋补中药材，具有很好的保健作用及很高的药用价值。液体深层发酵技术是一种具有较大开发利用前景的灵芝生产方法。本实验利用液体深层发酵技术，与传统的半合成培养基进行对比，观察灵芝菌丝生长状况及多糖含量的变化，设计了一种选用可食用原料按比例配制的液体天然培养基。结果表明：液体天然培养基配比为蔗糖40g/L，豆粉26g/L，钙镁片1.60g/L，氯化钾0.50g/L，灵芝菌丝生长旺盛，灵芝生物量为16.0g/L，胞外多糖含量为1.91g/L。关键词：灵芝；液体深层发酵；液体天然培养基；多糖

AbstractGanodermalucidumisakindofprecioustonicChineseherbalmedicine,Chinesemedicineithasverygoodhealthcarefunctionandmedicinalliquidsubmergedfermentationtechnologyofhighhavegreaterdevelopmentandutilizationprospectofganodermalucidumisakindofproductionmethodofthisexperimentusingliquidsubmergedfermentationtechnology,comparedwiththetraditionalsemisyntheticmedium,thenobservethechangesofganodermalucidumhyphagrowthandpolysaccharidecontent,designakindofnaturalediblerawmaterialsaccordingtotheproportionoftheliquidculturemedium.Theresultsshowedthat:theproportionofliquidnaturalmediumwassucrose40g/L,soybeanpowder26g/L,calciumandmagnesiumtablets1.60g/L,potassiumchloride0.50g/L,thegrowthofganodermalucidummyceliumwasvigorous,thebiomassofganodermalucidumwas16.0g/L,andthecontentofextracellularpolysaccharidewas1.91g/LKeywords：Ganodermalucidum;Liquidfermentation;Liquidnaturalmedium;polysaccharide目录1引言 21.1灵芝概述 21.2灵芝保健功能及价值 21.3灵芝主要活性成分 31.3.1灵芝多糖 31.3.2三萜类化合物 31.3.3灵芝蛋白质和氨基酸 31.4灵芝液体深层发酵 41.5研究背景及意义 42材料和方法 52.1材料、药品和仪器 52.1.1菌种 52.1.2主要试剂 52.1.3主要仪器设备 52.2方法 52.2.1菌种活化 52.2.2液体培养基 62.2.3种子培养及液体发酵 62.2.4单因素试验 62.2.5响应面设计 62.3发酵参数测定方法 72.3.1生物量测定－－干重法 72.3.2胞外多糖的测定 73结果与分析 73.1单因素试验 73.1.1不同浓度的豆粉对灵芝生物量的影响效果 73.1.2不同浓度的钙镁片对灵芝生物量的影响效果 83.1.3不同浓度的氯化钾对灵芝生物量的影响效果 93.2响应面设计 93.3响应面分析 103.3.1响应面分析 103.3.2响应面结果验证 154讨论 15致谢 17参考文献 18灵芝液体发酵天然培养基响应面优化研究1引言1.1灵芝概述灵芝(Ganodermalucidum)属于真菌界（Eumycota）,担子菌门(Basidiomycota),担子菌纲(Basidiomycetes),非褶菌目(Aphyllophorales)，灵芝科(Ganodermataceae)，灵芝属(Ganoderma)真菌[1]。灵芝的化学组成复杂，目前通过分离得到的化合物有150多种，可将其分为多糖类、三萜类、氨基酸蛋白质类、核苷类、微量元素、生物碱类、油脂类等10大类[2]。灵芝普遍分布于全世界各地，如今已有250多个种被记录，主要生长在气候湿热地区。我国的灵芝真菌资源分布较为广泛，主要散布于北京、浙江、福建、江苏、江西、河北、山东、湖北、湖南、广东、广西、河南、云南、四川、陕西、西藏、台湾等地[3]。1.2灵芝保健功能及价值灵芝是非常珍贵的药用真菌，在我国有长达两千多年的药用历史，素有灵丹妙药之美誉。现代医学研究已经表明：灵芝具有提高机体免疫力,降血脂、降血压、降血糖，增强心脏活力,保护肝脏,抗氧化及抗衰老等作用[4－7],广泛应用于免疫治疗神经衰弱、慢性肝炎、支气管炎、高血压、胃溃疡、糖尿病及肿瘤等[8]。同时，灵芝作为一种药食同源的菌类，具有很高的营养食用价值。早在两千多年前，中国就有针对食用灵芝的记载，李时珍[9]在《本草纲目》一书中也指出：“昔四酷采芝，群仙服食，则芝菌属可食者，故移入菜部”，并在随后的几千年发展中赋予了灵芝饮食文化极其丰富的文化内涵。灵芝除了传统的煲汤、煎水等食用方法外，随着人们对灵芝认识的不断加深和科技的不断发展，灵芝的食用方法也有了更多的创新。如目前最有开发前景的功能性食品是将灵芝多糖加入啤酒、茶、咖啡中从而完善其原有风味。种类丰富的灵芝产品不仅极大地开辟了灵芝食品市场，而且已经投入生产的灵芝制剂也均取得了一定的临床疗效[10]。1.3灵芝主要活性成分1.3.1灵芝多糖灵芝多糖约有200多种，大多为杂多糖[12，13]，包含了胞内多糖和胞外多糖[14]，是灵芝提取物中最关键的药效成分之一[11],它主要来源于菌丝体、子实体、灵芝发酵胞外液以及孢子粉。灵芝多糖的药理作用包括免疫调节、抗肿瘤、抗衰老[51]、降血糖、抗糖尿病及其并发症、抗炎、抗菌等[15－17]。由此，灵芝多糖引起了国内外学者的广泛关注和药科技工作者的重视。1.3.2三萜类化合物三萜类化合物是一种特殊的化学成分，在灵芝中占比较高。目前，主要是从灵芝子实体、菌丝体以及孢子粉中分离而得。对其结构进行分析[18]，主要包含灵芝酸、灵芝醇、灵芝醛等等，其中以灵芝酸为最主要的活性物质[31]。三萜类化合物具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒保肝、抗HIV、抵抗过敏、降低血压、降胆固醇和预防龋齿等多种保健作用[19]。1.3.3灵芝蛋白质和氨基酸灵芝蛋白质是除了多糖和三萜类物质外，另一种重要的活性物质[20]。如今，灵芝蛋白质的研究越来越受到人们的重视，各项报道表明其结构和生物活性的研究均获得了重大进展。灵芝中主要包括糖蛋白、免疫调节蛋白、酶、凝集素等多种蛋白质[18]，在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗癌作用上疗效显著[23]。灵芝中还含有多种人体所必需的氨基酸[30]，具有很高的营养食用价值。1.4灵芝液体深层发酵20世纪40年代末期，食用菌液体深层发酵的研究出现在人们的视野中。最早对液体深层培养进行研究的是1948年在美国的Humfeld等应用深层发酵培养蘑菇菌丝体，而后,液体深层发酵技术就成为了食用菌培养中较为主要的一项技术。上海植物生理研究所陈美幸等人于1960年进行香菇深层发酵研究是我国较早对深层发酵技术的应用[22]。与传统的生产方法相比较，食用菌液体深层发酵技术具备更为明显的优势。PH、氧气饱和度、温度和碳氮比等是与菌丝细胞生长息息相关的重要因素，在液体深层培养中不仅可以将生长环境调节成菌丝细胞最适宜的状态，使其能在短时间内产生丰富的菌丝体。液体深层发酵技术可使食用菌生产菌丝的生长环境无差异，进而缩短周期，促进产量的增加和保证质量的稳定，可以实现规模化生产。研究还表明，液体深层发酵培养所获得的菌丝体,其营养成分与子实体、菌核营养成分相当[21]。因此，食用菌液体深层发酵技术值得进行更为深入的研究与开发。1.5研究背景及意义[25－28]，但是传统的灵芝深层发酵培养基多是人工合成的，其中可能添加某些提高产量的化学药品，所以这些培养基需要投入较高成本，且安全性较难保证，营养单一，不合适用作食品开发的原材料和产品，因此，深层发酵的滤液往往被废弃，限制了灵芝功能性饮品的发展。经测定,滤液营养十分丰富,含有各种未被利用的营养活性物质，这些物质功能活性高，值得被进一步利用[24]。本实验设计了一种选用可食用原料按比例配制的液体天然培养基，不添加任何化学药品来培养灵芝，发酵后的菌丝体烘干制成菌粉或用于提取活性成分应用于医药和保健品行业，同时由于培养基中添加的成分均可食用，发酵液可通过精深加工处理制成饮料,风味独特,具有很高的营养食用价值，为研发新型饮料、进一步开辟食用菌资源有一定的现实意义。2材料和方法2.1材料、药品和仪器2.1.1菌种灵芝菌种34号，宁德师范学院生命科学学院微生物工程实验室提供。2.1.2主要试剂琼脂；葡萄糖；蔗糖；酵母粉；玉米粉；豆粉；磷酸二氢钾；硫酸镁；钙镁片；氯化钾；5%苯酚；浓硫酸；95%乙醇；实验用水均为去离子水。2.1.3主要仪器设备表2-1主要仪器设备仪器或设备名称型号生产厂家鼓风干燥箱DHG-9023A上海飞越实验仪器有限公司紫外可见分光光度计UV-5800PC上海元析仪器有限公司恒温培养摇床THZ-103B上海一恒科学仪器有限公司离心机TDZ5-WS上海卢湘仪器有限公司手提式压力蒸汽灭菌锅YXQ-SG46-280S上海三申医疗器械有限公司双人单面净化工作台SW-CJ-2D上海沪净医疗器械有限公司电子天平YP802N上海精密科学仪器有限公司移液枪Ppetman系列法国吉尔森多功能电磁炉C21-RK2101上海元山电器工业有限公司恒温水浴锅HH-4常州亿通分析仪器制造有限公司2.2方法2.2.1菌种活化配制PDA培养基，分装到150ml玻璃试管内，121℃高压灭菌20分钟，摆斜面冷却至室温。在超净工作台上将灵芝菌丝块接种至PDA培养基，于25℃恒温培养箱中培养6天，待菌丝铺满斜面2/3，菌丝茁壮致密，将其放入4℃冰箱保藏，即为斜面菌种。2.2.2液体培养基PDB培养基：将马铃薯切块，称取200g，加入1L去离子水煮沸直至玻璃棒可轻易戳碎马铃薯，用纱布过滤后加入20g葡萄糖搅拌至完全融化，倒入容量瓶中定容至1L。用量筒分别取80ml装至250ml锥形瓶中，然后121℃高压灭菌2h后取出，冷却至室温待用。2.2.3种子培养及液体发酵将PDB培养基与菌种置于超净工作台上紫外灭菌45分钟左右后，将菌种接种到PDB培养基中，然后置于恒温培养摇床中（28℃，160rpm）培养4-5天。培养期间，观察生长情况。4-5天后，菌丝体生长良好，大小均匀，发酵液透明不浑浊，则可将菌种从PDB培养基中接种到半合成培养基和天然培养基中，然后置于恒温培养摇床中（28℃，160rpm）培养4-5天。培养期间，观察灵芝菌丝体生长状况和发酵液情况。2.2.4单因素试验豆粉浓度优化培养基：4%蔗糖+（0.3%～2.5%）豆粉+0.1%磷酸二氢钾+0.05%硫酸镁+1L去离子水，PH自然。钙镁片浓度优化培养基：4%蔗糖+2.1%豆粉+0.1%磷酸二氢钾+（0.032%～0.192%）钙镁片+1L去离子水，PH自然。氯化钾浓度优化培养基：4%蔗糖+2.1%豆粉+（0.0125%～0.075%）氯化钾+0.128%钙镁片+1L去离子水，PH自然。在确定液体天然培养基的碳源为蔗糖，氮源为豆粉时进行培养基优化。首先对豆粉的浓度进行优化，选取豆粉浓度选取3g/L～25g/L；在确定最优豆粉浓度后，对钙镁片的浓度进行优化，其浓度选取0.32g/L～1.92g/L；确定最优钙镁片浓度后，对氯化钾的浓度进行优化，浓度选取0.125g/L～0.75g/L.2.2.5响应面设计Box-Behnken设计适用于多个要素的优化试验。本实验以蔗糖、豆粉、钙镁片、氯化钾作为自变量（X1、X2、X3、X4），灵芝生物量作为响应，运用Design-Expert软件对试验结果进行响应面分析。表2-2自变量浓度范围设计自变量（g/L）最低浓度（g/L）均值浓度（g/L）最高浓度（g/L）蔗糖浓度254055豆粉浓度162126钙镁片浓度0.961.281.60氯化钾浓度0.380.500.622.3发酵参数测定方法2.3.1生物量测定－－干重法用四层纱布分别过滤半合成培养基和天然培养基，收集发酵液和菌丝体。其中，菌丝体用无菌水清洗3次以上，放鼓风干燥箱中65℃烘干至恒重（时长24h），在电子天平上称量菌丝体干重。2.3.2胞外多糖的测定3结果与分析3.1单因素试验3.1.1不同浓度的豆粉对灵芝生物量的影响效果图3-1不同浓度的豆粉对灵芝生物量的影响效果，由图3-1可知，随着豆粉浓度不断升高，灵芝生物量呈先增加后减少的趋势，当豆粉浓度达到21g/L时，灵芝生物量最多，可达14.75g/L，且上升趋势较大。3.1.2不同浓度的钙镁片对灵芝生物量的影响效果图3-2不同浓度的钙镁片对灵芝生物量的影响效果蔗糖浓度为40g/L，豆粉浓度为21g/L时，磷酸二氢钾浓度为1g/L，由图3-2可知，随着钙镁片浓度不断升高，灵芝生物量呈先增加后减少再增加的趋势，当钙镁片浓度为1.28g/L时，灵芝生物量最高，可达17.25g/L。虽然当钙镁片浓度进一步提高至1.92g/L后仍有上升，考虑到成本问题，选择钙镁片浓度为1.28g/L作为合适配比。3.1.3不同浓度的氯化钾对灵芝生物量的影响效果图3-3不同浓度的氯化钾对灵芝生物量的影响效果蔗糖浓度为40g/L，豆粉浓度为21g/L时，钙镁片浓度为1.28g/L，由图3-3可知，随氯化钾浓度不断升高，灵芝生物量呈先减少后增加再减少的趋势，当氯化钾浓度达到0.5g/L时，灵芝生物量最多，可达15.63g/L。3.2响应面设计Box-Behnken试验设计及结果见表3-4表3-4BBD试验设计及结果序号蔗糖浓度（g/L）豆粉浓度（g/L）钙镁片浓度（g/L）氯化钾浓度（g/L）生物量（g/L）140.0021.001.280.5013.125255.0021.001.280.6214.375

325.00

26.001.280.5012.375440.0026.000.960.5015.250

525.0021.001.280.6213.625640.0016.000.960.5012.000

725.0021.001.280.3813.500855.0021.000.960.5012.500

940.0016.001.280.6212.750

1040.0026.001.280.3814.0001155.0016.001.280.5011.375

1240.0026.001.600.5016.000

1340.00

26.001.280.6215.6251455.0026.001.280.5014.125

1540.0021.001.600.3813.500

1625.0016.001.280.5011.8751740.0016.001.280.3812.625

1855.0021.001.600.5013.7501940.0016.001.600.5012.7502040.0021.001.600.6213.5002125.0021.000.960.5013.500

2240.0021.000.960.6212.625

序号蔗糖浓度（g/L）豆粉浓度（g/L）钙镁片浓度（g/L）氯化钾浓度（g/L）生物量（g/L）2340.0021.000.960.3814.250

2455.0021.001.280.3812.750

2525.0021.001.600.5014.1253.3响应面分析3.3.1响应面分析图3-5由三维分析图可知，蔗糖浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随豆粉浓度的升高而增加。豆粉浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随蔗糖浓度的升高先增加后减少。图3-6豆粉与钙镁片交互作用的响应面图3-3所示，豆粉与钙镁片的等高线不呈椭圆形，交互作用显著，由三维分析图可知，钙镁片浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随豆粉浓度的升高而增加。豆粉浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随钙镁片浓度的升高而增加。图3-7钙镁片与氯化钾交互作用的响应面图3-4所示，钙镁片与氯化钾的等高线不呈椭圆形，交互作用显著，由三维分析图可知，钙镁片浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随氯化钾浓度的升高而增加。氯化钾浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随钙镁片浓度的升高而增加。图3-8蔗糖与氯化钾交互作用的响应面图3-5所示，蔗糖与氯化钾的等高线不呈椭圆形，交互作用显著，由三维分析图可知，蔗糖浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随氯化钾浓度的升高而增加。氯化钾浓度固定时，灵芝菌丝体生物量随蔗糖浓度的升高先增加后减少。3.3.2响应面结果验证运用Design-Expert软件预测最佳培养基的配方为蔗糖40g/L，豆粉26g/L，钙镁片1.60g/L，氯化钾0.50g/L，生物量可达14.8506g/L。在此预测下进行发酵试验，所得实际生物量为16.0g/L，与预测值较为接近。4讨论传统上，灵芝主要来源于野外采集或人工栽培，但其所需培养空间大，生长周期较长，劳动强度大，生产效率低，又容易受环境、气候等因素影响，产量与质量难以把控。目前，随着液体深层发酵技术被不断开发，其技术具有占地少、原料广泛、工艺简单、周期短效率高、副产物少等优点；同时利用深层发酵技术可以在短时间内培养出大量的菌丝体，大大缩短生产原种和栽培种的时间。利用液体深层发酵技术培养灵芝，更大程度地发挥了灵芝的营养价值，因此灵芝液体深层发酵法已成为灵芝研究的重要内容，具有极大的发展前景。目前，液体深层发酵技术的研究主要集中在菌株的选用、培养基的筛选和培养条件的优化上,这大大改良了灵芝液体深层发酵技术。但仍存在着一些问题：大多数液体深层发酵采用合成或半合成培养基，其中添加大量金属离子如Mg2+、K+等以及其他化学药品，导致发酵结束后发酵液不能被有效利用，造成浪费，不利于功能性饮品的开发。本实验通过改良传统培养基成分，选用均可食用成分设计液体天然培养基，结果表明：液体天然培养基配比为蔗糖40g/L，豆粉26g/L，钙镁片1.60g/L，氯化钾0.50g/L，相比于半合成培养基，其灵芝菌丝生长状况较好，菌丝体生物量可达16.0g/L，提高了11.31%，胞外多糖含量为1.91g/L，提高了24.03%。本研究选择蔗糖作为碳源、豆粉作为氮源配制发酵培养基，并添加钙镁片和氯化钾作为灵芝生长所需的金属离子来源，提高了活性成分的产量。此外，就利用发酵液的角度而言，发酵液营养十分丰富,含有各种未被利用的营养活性物质，但半合成培养基所含化学试剂成分较多，安全性差，造成发酵液难以再次利用；而天然培养基中的组分均是可食用的，这就解决了发酵液的浪费问题。就培养基来源、成本预算的角度而言，蔗糖、豆粉、钙镁片及氯化钾来源广泛、价格低廉，适用于食用菌及其代谢产物的大规模工业化生产。参考文献崔晓莹.灵芝中的三萜类化合物（灵芝酸）的提取条件优化及其结构分析[D].东北师范大学,2007.陈玉,刘流,牛艳芬.灵芝化学成分的研究[J].中南民族大学学报(自然科学版),2016,35(02):10-14.[2]李钦艳,陈逸湘,钟莹莹.灵芝主要活性成分及其功能的研究进展(综述)[J].食药用菌,2015,23(02):86-91.华蓉,杨珍福,张陶.神奇的药用真菌——灵芝[J].云南科技管理,2015,28(06):35-37.任奕.灵芝液体深层发酵的影响因素研究进展[J].农业科技与装备,2018(06):55-56+61.AmenYhiyaM,ZhuQinchang,TranHai-Bang,AfifiMohamedS,HalimAhmedF,AshourAhmed,MiraAmira,ShimizuKuniyoshi.LucidumolC,anewcytotoxiclanostanoidtriterpenefromGanodermalingzhiagainsthumancancercells.[J].Journalofnaturalmedicines,2016,70(3).Yong-MingYan,Xin-LongWang,Li-LiZhou,Feng-JiaoZhou,RongLi,YuanTian,Zhi-LiZuo,PingFang,ArthurC.K.Chung,Fan-FanHou,Yong-XianCheng.LingzhilactonesfromGanodermalingzhiameliorateadriamycin-inducednephropathyinmice[J].JournalofEthnopharmacology,2015,176.LiangGuo,JianhuiXie,YuanyuanRuan,LeiZhou,HaiyanZhu,XiaojingYun,YanJiang,LongLü,KangliChen,ZhihuiMin,YumeiWen,JianxinGu.CharacterizationandimmunostimulatoryactivityofapolysaccharidefromthesporesofGanodermalucidum[J].InternationalImmunopharmacology,2009,9(10).才晓玲,何伟,杨国琴.灵芝多糖生物活性研究进展[J].食用菌,2018,40(03):1-4.华敏.中国灵芝饮食的历史变迁与发展展望[J].南宁职业技术学院学报，2009,14(06):6-9.[10]肖智杰,王进军,连宾.灵芝产品的研究与开发现状[J].食品科学,2006(12):837-842.[11]JieLiu,KuniyoshiShimizu,FumikoKonishi,KiyoshiNoda,ShoichiroKumamoto,KenjiKurashiki,RyuichiroKondo.Anti-androgenicactivitiesofthetriterpenoidsfractionofGanodermalucidum[J].FoodChemistry,2006,100(4).[12]张汇,聂少平,艾连中,夏永军,熊智强,王光强.灵芝多糖的结构及其表征方法研究进展[J/OL].中国食品学报:1-12[2020-01-05]./kcms/detail/11.4528.TS.20191223.1203.006.html.[13]刘良琴.灵芝多糖的提取纯化、结构表征及灵芝茶的质量控制研究[D].贵州师范大学,2017.[14]张华斌,石松生,陈春美.灵芝多糖抗肿瘤免疫机制的研究进展[J].医学综述,2016,22(02):259-262.[15]王颖,魏佳韵,吴思佳,章春豪,王兴亚.灵芝多糖结构特征及药理作用的研究进展[J].中成药,2019,41(03):627-635.[16]QiaoDing,ShaopingNie,JielunHu,XinyanZong,QiqiongLi,MingyongXie.InvitroandinvivogastrointestinaldigestionandfermentationofthepolysaccharidefromGanod