边做边学以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数量测定课件

土壤中分解尿素的细菌的

分离与计数徐州京师未来实验学校 梁婧娴1学习目标1、

简述稀释涂布平板法分离微生物和进行微生物计数的实验原理2、学会用稀释涂布平板法进行微生物数量测定的方法1、了解尿素尿素是一种由C、H、O、N组成的有机化合物，分子式为CO(NH2)2，它是动物体内蛋白质代谢的产物，在肝脏中合成后，随尿液排出。1828年，德国化学家维勒成功通过无机物的化学反应合成了尿素。此后，尿素走向工业化并广泛用于农业生产。背景知识2、尿素的利用尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的某些细菌将

尿素分解成氨之后才能被植物利用。3、细菌能分解尿素的原因直接原因：能合成脲酶（分解尿素的酶）根本原因：具有合成脲酶相关的基因CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3研究目的1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。筛选菌株原理统计菌落数目设置对照与重复设计实验研究思路（一）筛选菌株水生耐热细菌Taq耐高温的Taq

DNA聚合酶选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。怎样筛选特定微生物呢?思考：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g加蒸馏水定容至1000ml培养基选择分解尿素的微生物的原理？培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培

养基就能够选择出分解尿素的微生物。请你来描述1.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液

的体积(ml)，M代表稀释倍数。2、显微镜直接计数（二）统计菌落数目（三）设置对照与重复设置对照的主要目的是排除实验组中

非测试因素(无关变量)对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。同一稀释倍数设置三个重复，取其平均值，以减少误差，提高实验的准确性。土壤取样制备培养基制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。（四）实验设计应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。（无菌环境下）分离不同的微生物采用不同的稀释度

原因：不同微生物在土壤中含量不同3.样品的稀释4.取样涂布实验时要对

培养皿作好标

记。注明培养

基类型、培养

时间、稀释度、培养物等。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。5.微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d。放线菌：25～28℃培养5～7d。霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。稀释度是不是越高越好？如果稀释度过高，菌落数少于30，计算结果偏低，误差大；如果稀释度过低，菌落数超过300，统计和计算结果都会有误差。统计的菌落数与活菌实际数目相比偏大还是偏小？思考：③分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如因为当两个或多果相差太大，意味着操作有误，需个重细新胞实连验在。一起④为防止培养时间不足导致菌落遗漏时，，在繁菌殖落后计数形时成，每隔24h统计一次菌落数，选取菌的落数还稳是定一时个的菌记落录作为结果。⑤统计的菌落数往往比活菌实际数目低。注意事项①

恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②

为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。动动脑拓展延伸利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。鉴定在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养该细菌，如果

PH升高，指示剂变红，可以初步鉴定该种菌能分解尿素。课题小结实验