猪氟烷阳性的研究

猪氟烷阳性的研究

自futii等人（1991年）确定了猪氟烷基因的磷酸序列和突变位点以来，pcr技术和不同的氟烷基因型的检测方法日益先进。90年代以前普遍使用的氟烷测定不能检出杂合子,在育种场的使用趋于停止。国际上一些较大的种猪公司,如英国种猪改良公司(PIC,美国公司),其基因型检测已完全取代了氟烷测验。氟烷基因是导致猪应激综合征(PigStressSyndromePSS)的主要遗传学病因。随着对PSS的深入研究,发现若干外界刺激因子包括屠宰前驱赶和混群等能够影响不同基因型猪群PSE(Pale,Soft,Exudative)肉的发生率,但对基因型与氟烷反应之间相互关系的研究迄今未见系统的报道,一般认为氟烷阳性猪的基因型应为隐性纯合子(nn)。本研究对含1/2中国猪血统继代选育猪群(SJ母系)进行氟烷测验的同时对部分个体进行了氟烷基因的PCR-RFLP分析,用基因检测的方法,首次发现了基因型为杂合子(Nn)的氟烷反应阳性猪。1材料和方法1.1氟烷阳性猪窝别、检测和制备供试猪系江苏省农业科学院种猪试验场培育的SJ母系三世代猪群,在体重15～20kg时每窝随机抽取2公2母(计147头)进行氟烷测验,对氟烷阳性猪的窝别于两周后重复测验,并采集阳性猪及其同胞的血液以制备基因组DNA。1.2烟气流量测定采用欧洲常用方法,用日产兽用麻醉机和氟烷,测验步骤如下:起始氟烷浓度为4%,持续4min后改为1%1min;氧气流量始终为2.5～3.0L/min,总测定时间为5min。供试猪在麻醉0～3min时保持侧卧,3～4min时保持仰卧,4～5min时恢复至侧卧状态,自45～60s时起开始轻轻抓住上侧后肢蹄部屈伸,如果出现后肢屈伸低抗,胸腹部肌肉开始强直时将猪立即转为仰卧,确认反应为阳性后中止麻醉。1.3dna分离和测定法采全血25mL,肝素抗凝,缓慢加入到等量国产淋巴细胞分离液中1500r/min,离心10min,吸取白细胞后采用ASAP基因组DN分离盒进行RNA酶和蛋白酶消化并分离,将获得的基因组DNA用双蒸水定量稀释成10ng/μL备用。1.4两种溶液的混合按OtsuK的方法合成引物A和引物B,PCR反应液的组成如下:基因组DNA10μL(100ng);dNTPs5μL(2mM);MgCl21μL(25mM);引物A1μL(11.8μΜ);引物B1μL(12.4μΜ);双蒸水28μL。上述溶液混合后加入Tag酶2IU(4μL),反应体积合计为50μL。反应温度:第1循环为94℃2min45s→65℃45s→72℃60s,第2循环为94℃45s→65℃45s→72℃60s,重复第2循环35次后置于4℃保存或电泳。1.5酶切产物的扩增和电泳PCR产物15μL加入2μL(2.5ΙU)AspH1内切酶37℃水浴1h。扩增和酶切产物用1.5%琼脂糖100～120V电泳40min。然后经Et-Br染色10min后观察结果。2结果与分析2.1全同性生存率首次测验阳性猪3头,阳性率为2.04%,其耳号分别为337、306和208,其中337和306为全同胞,且306在测验中途应激抢救无效死亡。2.2基因组dna的获得和pcr检测采集337及其同胞331、208及其同胞206共4头猪的全血各25mL,经分离和酶解后分别获得约500μL基因组DNA,其浓度均为1.0～1.5μg/μL,定量稀释成10ng/μL后进行PCR反应。2.3盐藻阿波多聚甲基苯磺酸钠盐和盐析产物t-qp1色图1PCR产物及4头猪酶切片断的电泳图谱见示意图1,自右向左分别为206号猪基因组DNA的PCR产物、337、331、208、206四头猪酶切片断及174(HaeⅢ)标记片断。根据理论推测,AspH1将N基因的659片断切成524和135两段,而将n基因的659片断切成358,166和135三段。所以杂合子(Nn)酶切产物应具备524、358、166、135bp四条带(图中2、3泳道),隐性纯合子(nn)应具备358、166和135三条带(图中4、5泳道),显性纯合子(NN)应具备524和135两条带(图中没有)。可见,337和331为隐性纯合子,208和206为杂合子。3基因型pcr检测据SJ母系猪检测结果,其中337和331为隐性纯合子,氟烷反应阳性,206号为杂合子,氟烷反应阴性均与一般规律相符,但208号猪为杂合子,而氟烷反应阳性,国内外尚未见同类报道。在氟烷基因DNA检测方法建立之前,大都采用测交与氟烷测验结合的办法判断基因型。Webb和Smith(1976)使用氟烷阳性的皮特兰猪与氟烷阳性汉普夏猪交配,在75头后代中测得96%个体为氟烷阳性,4%为阴性,即隐性纯合子中出现有氟烷阴性个体。Mabry(1981)研究结果进一步证实氟烷基因具有不完全的外显率。由于基因型PCR检测方法建立较迟,故缺乏对氟烷阳性猪是否一定是隐性纯合子的系统研究。基因检测结果证实氟烷基因型对产生PSE肉的作用受到外界刺激因子的显著影响。Christian等人(1980)对应激反应程度进行评分,发现三种基因型(NN,Nn,nn)之间存在显著的差异,但也有少数个体的评分结果与基因型不相符合,但没有指明是否存在非隐性纯合子出现氟烷反应阳性的情况。综上所述,迄今尚