高温胁迫对常绿亚属杜鹃幼苗叶片生理生化特性的影响

高温胁迫对常绿亚属杜鹃幼苗叶片生理生化特性的影响

多年生杜鹃属植物，属于杜鹃科和杜鹃科。世界上有270种,中国是其分布中心,有259种(其中特有种190种),主要分布于西南高海拔地区。该亚属植物株形优美、花大色艳、四季常绿,具有极高的观赏价值;但对生态环境要求较严,性喜冷凉湿润气候,高温热害是制约其引种驯化和利用的主要限制因子。高温可引发植物体代谢失衡和活性氧的大量产生,加剧细胞膜脂过氧化作用,从而影响生物膜和其它大分子的结构与功能,严重时导致细胞死亡,而植物能启动抗氧化系统等应急机制,以减轻或避免活性氧对植物的伤害。国外针对杜鹃花的温度胁迫生理方面的研究主要集中在低温条件下叶绿素、光合作用、蛋白质组成及矿物质含量变化以及叶片感热运动对低温的适应等方面。Wang等发现,在季节性自然降温过程中,两种常绿亚属杜鹃(R.ponticum和R.catawbiense)叶片的丙二醛(MDA)、抗坏血酸(AsA)含量及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性均随着温度的降低而大幅增加,而超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性增幅较小。国内对杜鹃花的低温、水分及SO2胁迫生理的研究已有报道,但对其重要生态因子——高温胁迫生理的研究报道较少。为探讨常绿杜鹃亚属植物的高温致伤机理,本实验以耐热性不同的2种杜鹃为材料,研究了不同高温条件下其叶片生理生化特征的变化规律,以期为常绿亚属杜鹃的耐热性鉴定及物种筛选、园林应用提供依据,同时为珍稀濒危杜鹃的引种驯化和多样性保育提供借鉴。1材料和方法1.1选用和推广使用适合我国不同的种子猴头杜鹃分布地域较广,产于江西、安徽、福建、广东、广西、贵州、海南及浙江、湖南南部,生于海拔500~1800m的山坡林中,在我国华东、华南庭园中已见栽培;井冈山杜鹃分布地域狭窄、数量稀少,生于江西省井冈山地区海拔1100~1200m的阔叶林下,为江西特有种和二级保护物种,对生境要求较严、目前未见庭园应用。笔者经过多年的引种驯化研究,发现猴头杜鹃耐热性较强,在庐山栽培适应性良好;井冈山杜鹃耐热性较弱,在庐山适宜栽培于冷晾阴湿的林下、林缘及水沟旁,空旷地带栽培时春季生长良好,但夏季多因高温而出现叶片反卷、失绿、黄斑等受害症状,适应性一般。庐山植物园杜鹃花推广研究表明,猴头杜鹃能较好地适应江西南昌、九江等平原地区的林下环境;井冈山杜鹃在平原地区林下栽培时春季能正常生长,但夏季出现叶尖叶缘焦枯,叶片发黄、卷缩、脱落,茎干失水萎缩等热害症状,难以安全过夏。因此,我们选取耐热性不同的这两种杜鹃作为本实验的材料。猴头杜鹃(RhododendronsimiarumHance)、井冈山杜鹃(R.jinggangshanicumTam)取自庐山植物园,为同一批次播种的四年生实生苗。1.2温度对养护的影响将大小一致、生长健壮的苗木栽植于高9cm、上口径11.5cm、下口径8.5cm的塑料盆中,每盆1株,栽培基质为庐山林下表层腐殖土(主要理化性状为:有机质10.87%,腐殖质6.63%,速氮、速磷、速钾分别为266.20、22.17、83.65mg/kg,pH值4.79),在冷温室中养护管理,2个月后进行实验处理。实验于人工气候箱中进行,采用22℃(对照)、30℃(轻度高温胁迫)、38℃(重度高温胁迫)3个温度梯度处理,培养箱空气相对湿度80%、光照12h/12h(光/暗)、光强约120μmol·m-2·s-1。为减轻高温引发的水分胁迫伤害,盆底设置托盘(水深1~1.5cm)补充基质水分并每天补水保湿。每个温度处理在同一个气候箱中进行,并按气候箱的分隔层设计3次重复,每重复6株,6d后取6株幼苗的当年生功能叶测定相关生理生化指标。1.3指标和方法的测量1.3.1mda含量测定参考赵世杰等的方法,并在前期实验的基础上进行了改进。分别称取杜鹃叶片0.5g,加入10%三氯乙酸(TCA)和0.25%硫代巴比妥酸(TBA)混合液5mL,并加入少许石英砂研磨成匀浆,沸水中加热30min,冰浴速冷,10000g离心10min,取上清液于分光光度计上分别测定450、532、600nm处的吸光值OD450、OD532和OD600,根据公式[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]计算MDA含量,单位为μmol·g-1FW。1.3.2测定氧化b22的含量采用Velikova等的方法,于390nm处测其吸光值,根据标准曲线求得H2O2含量,单位为μmol·g-1FW。1.3.3脯氨酸含量测定参考酸性茚三酮法,并进行改进。取鲜叶0.5g,加入石英砂及3%磺基水杨酸5mL研磨,沸水浴10min,冷却后765g离心10min,取上清液1mL,并加入1mL冰醋酸、1mL蒸馏水和2mL酸性茚三酮再沸水煮60min,冷却,加入4mL甲苯,震荡30s,静置分层,取上层液于520nm波长处测吸光值OD520,根据标准曲线计算脯氨酸含量,单位为μg·g-1FW。1.3.4测定了可溶性蛋白质含量采用Bradford的方法,于595nm处测定吸光值OD595,根据标准曲线计算可溶性蛋白含量,单位为mg·g-1FW。1.3.5离心液的制备参考蔡卓等的方法,并进行改进。取0.5g叶片,加入石英砂及5mL10%TCA研磨,匀浆于10000g离心5min。取上清液2mL,分别加入4mL1mol/L硫酸及2mL5mol/L重铬酸钾溶液,定容至25mL,反应30min后,测其350nm处的吸光值OD350,根据标准曲线求得抗坏血酸含量,其单位表示为mg·g-1FW。1.3.6酶活性的测定称取0.5g叶片,加入5mL预冷的50mmol/LPBS(pH7.0)缓冲液(内含2%PVP、5mmol/LEDTA-Na2、5mmol/LDTT、5mmol/LAsA),冰浴研磨,匀浆液于4℃、15000g离心15min,取上清液用于酶活性的测定。SOD活性测定采用Spychalla等的方法,以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%为一个酶活性单位,表示为U·g-1FW;CAT活性测定采用Turkan等的方法,以每分钟OD240值变化0.1为一个酶活力单位,表示为U·g-1FW·min-1;POD活性测定采用Wu等的方法,以每分钟OD470值变化0.01为一个酶活力单位,表示为U·g-1FW·min-1;APX活性测定采用Nakano等的方法,以每分钟OD290变化0.01为一个酶活性单位,表示为U·g-1FW·min-1。1.4处理数据实验数据经整理后采用SPSS17.0软件进行差异显著性分析,用Excel绘制数据图。2结果与分析2.1高温扰动对叶片中sda和b2o含量的影响2.1.1不同温度对叶片mda含量的影响MDA是膜脂过氧化作用的产物,对细胞膜有毒害作用,其含量高低被作为活性氧伤害的重要指标。从图1:A可见,在对照(22℃)处理时2种杜鹃叶片的MDA含量差异不大,高温胁迫下均随着温度的升高而逐渐增大,且变化趋势一致。从表1可见,猴头杜鹃、井冈山杜鹃在30℃、38℃处理时,MDA分别比对照增加了30.70%、134.96%和38.41%、103.96%。方差分析表明,2种杜鹃在3个温度处理间均达到显著差异(p<0.05),但同一处理不同的种间均差异不显著(p>0.05)。可见,高温会诱发杜鹃的膜脂过氧化作用,并随着胁迫温度的升高而加重。2.1.2对高温胁迫下、32处理对现场实测结果的影响逆境条件下,植物体内活性氧代谢加强,使H2O2发生积累。由图1:B及表1可以看出,2种杜鹃叶片H2O2含量均随着胁迫温度的升高而增加,且3个温度条件下猴头杜鹃H2O2含量均明显小于井冈山杜鹃。猴头杜鹃在30℃处理时H2O2含量增幅较小,仅比对照(22℃)增加11.95%;而38℃处理时虽然H2O2增幅较大,但绝对含量较低(仅为0.102μmol·g-1FW)。高温胁迫下,井冈山杜鹃H2O2大量产生,38℃处理时含量高达0.778μmol·g-1FW。方差分析表明,除猴头杜鹃30℃处理与对照间差异不显著(p>0.05)外,2种杜鹃在3个温度处理间均达到显著差异(p<0.05);同一处理不同的种间也均达到显著差异(p<0.05)。可见,高温会诱导活性氧的产生,特别是由30℃上升到38℃时,H2O2大量积累,植物受害加重;在3个温度条件下井冈山杜鹃H2O2含量均显著大于猴头杜鹃(达7倍以上),表明井冈山杜鹃清除活性氧的能力较弱,H2O2的大量积累是其受高温伤害的重要原因之一。2.2高温扰动对叶片渗透和物质浓度的影响2.2.1不同温度对植物叶片pro含量的影响Pro是植物体内重要的渗透调节物质,能调节细胞的含水量和膨压,从而维持植物的正常生理功能。从图2:A及表1可见,随着胁迫温度的升高,2种杜鹃叶片Pro含量均逐渐升高,且3个温度条件下猴头杜鹃的Pro含量均大于井冈山杜鹃。猴头杜鹃30℃处理时Pro增幅较小、仅比对照增加9.98%,而在38℃处理时其Pro大量积累(含量达123.056μmol·g-1FW),比30℃处理增加60.51%。井冈山杜鹃30℃处理时Pro含量既迅速积累,但38℃处理时增幅较小(含量为65.299μmol·g-1FW),仅比30℃增加17.54%。方差分析表明,2种杜鹃在3个温度处理间均达到显著差异(p<0.05),同一处理不同的种间也均达到显著差异(p<0.05)。可见,在高温胁迫时2种杜鹃叶片能主动积累Pro,并随着胁迫程度的加重而增加,以减轻高温对细胞膜的伤害;同一处理(特别是38℃重度胁迫时)猴头杜鹃Pro含量显著大于井冈山杜鹃,说明耐逆热性较强的种在高温胁迫下积累的Pro较多,有利于提高植物对高温的抵御能力。2.2.2、合成猴头松茸对可溶性蛋白质的影响从图2:B及表1可见,2种杜鹃叶片可溶性蛋白质含量均随着胁迫温度的升高而增加,且3个温度条件下猴头杜鹃的含量均小于井冈山杜鹃。高温胁迫下,猴头杜鹃可溶性蛋白质增幅较小,在30℃、38℃处理时分别比对照增加55.38%、91.83%;而井冈山杜鹃的可溶性蛋白质却大幅增加,在30℃、38℃处理时分别比对照增加66.79%、209.44%。方差分析表明,井冈山杜鹃在3个处理间均达到显著差异(p<0.05),猴头杜鹃30℃、38℃处理与对照间达到显著差异(p<0.05),30℃与38℃处理间差异不显著(p>0.05);同一处理不同的种间在38℃处理时达到显著差异(p<0.05),而30℃处理、对照处理时差异不显著(p>0.05)。可溶性蛋白对维持细胞的膨压、抵御或减轻高温伤害有一定的保护作用,但高温胁迫下,特别是38℃重度胁迫时耐热性较弱的井冈山杜鹃可溶性蛋白质含量大幅增加并显著大于耐热性较强的猴头杜鹃,可能与耐热性弱的种其质膜更易遭受高温伤害、膜蛋白转变为可溶性蛋白质有关。2.3高温胁迫对a含量的影响AsA是非酶促清除系统中的主要抗氧化剂,具有多种抗氧化功能,逆境下其含量的高低能反映植物清除活性氧能力和抗逆性强弱。从图3及表1可以看出,2种杜鹃叶片AsA含量均随着胁迫温度的升高而逐渐降低。猴头杜鹃虽然在对照处理时AsA含量较井冈山杜鹃低,但高温胁迫时其降幅较小,30℃、38℃处理分别比对照降低19.22%、35.90%,在38℃时其含量为0.236mg·g-1FW,仅比30℃下降20.65%。高温胁迫下,井冈山杜鹃AsA含量大幅降低,30℃、38℃处理时分别比对照降低了27.68%和78.46%,在38℃时其含量仅为0.129mg·g-1FW,比30℃降低了70.22%。方差分析表明,2种杜鹃在3个温度处理间均达到显著差异(p<0.05),同一处理不同的种间也均呈显著差异(p<0.05)。可见,杜鹃作为高山花卉,耐热性差,高温诱发了其体内活性氧的大量产生,AsA在参与清除活性氧的过程中因消耗而降低;高温胁迫下、尤其是温度由30℃上升到38℃时井冈山杜鹃AsA含量大幅下降并显著低于猴头杜鹃,表明其清除活性氧的能力下降,更易受到高温的伤害。2.4种植物对高温胁迫及对复水的活性SOD是植物抗氧化系统的关键酶,催化O-.2歧化反应生成O2和H2O2,从而减轻逆境下O-.2对细胞的伤害,故SOD活性被认为是植物抵抗逆境的重要指标。从图4:A及表1可以看出,高温胁迫下,猴头杜鹃叶片SOD活性增幅明显大于井冈山杜鹃。30℃处理时猴头杜鹃SOD活性比对照增加了23.85%,38℃处理相对于30℃时其活性略有下降(1.62%),但仍比对照增加了21.85%。井冈山杜鹃SOD活性增幅较小,30℃、38℃处理仅分别比对照增加了3.77%和5.11%。方差分析表明,2种杜鹃在2个高温与对照间均达到显著差异(p<0.05)、而2个高温处理间均差异不显著(p>0.05);同一处理不同的种间在30℃处理、对照处理时达到显著差异(p<0.05),而在38℃处理时差异不显著(p>0.05)。CAT、POD、APX是植物体内清除H2O2的重要活性酶。从图4:B~D及表1可见,2种杜鹃叶片CAT、POD及APX活性均随着胁迫温度的升高而逐渐增大,且变化趋势相似。高温胁迫下,猴头杜鹃CAT活性增幅虽小于井冈山杜鹃,但在3个温度条件下其活性大小均显著大于井冈山杜鹃,特别是38℃重度胁迫时其活性达896.67U·g-1FW·min-1,比30℃时增加了65.12%;井冈山杜鹃在对照处理时CAT活性较低,30℃胁迫时迅速增加,但38℃重度胁迫时增幅较小(比30℃处理增加了39.76%),活性仅为614.17U·g-1FW·min-1。高温胁迫下,猴头杜鹃POD活性增幅明显大于井冈山杜鹃,30℃、38℃处理时其活性分别比对照增加了158.43%、349.44%;而井冈山杜鹃POD活性在30℃、38℃处理时仅分别比对照增加了44.44%、127.16%。猴头杜鹃APX活性虽然在对照条件下略低于井冈山杜鹃,但高温胁迫下、特别是38℃重度胁迫时急剧增加,其活性分别比对照、30℃处理增加了255.03%、144.21%;而井冈山杜鹃增幅相对较小,38℃胁迫时分别比对照、30℃处理增加了129.35%、72.29%。方差分析发现,2种杜鹃的CAT、POD及APX酶活性在3个温度处理间均呈显著差异(p<0.05);同一处理不同的种间CAT、APX酶活性均达到显著差异(p<0.05),但POD酶活性仅在2个高温处理时达到显著差异(p<0.05),而在对照处理时差异不显著(p>0.05)。可见,高温导致了杜鹃叶片活性氧的大量产生,从而诱导SOD、CAT、APX及POD等保护酶活性的增强,对清除H2O2、减轻细胞膜脂过氧化伤害起到了一定的保护作用;高温胁迫下,猴头杜鹃4种酶的活性或增幅总体大于井冈山杜鹃,表明其清除活性氧的能力强于井冈山杜鹃。3高温胁迫对植物加快作植物受逆境伤害的关键部位是生物膜系统。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一,可与膜蛋白、酶发生交联使膜透性增大、酶功能受损,还可与细胞内核酸、蛋白质等生物大分子发生反应,生成Schiff碱,进而破坏细胞膜的结构。大量研究表明,高温导致植物体内活性氧累积和MDA大幅增加,并认为MDA含量高低能反映细胞膜脂过氧化水平及植物耐热性强弱与受伤害程度。本试验结果表明,随着胁迫温度的升高,2种杜鹃叶片的MDA及H2O2含量均有不同程度的上升,表明高温诱导了其体内活性氧的产生和MDA积累,加剧了膜脂过氧化伤害。猴头杜鹃H2O2产生速率较低,在3种温度条件下其叶片H2O2含量及高温时的增幅均小于井冈山杜鹃,表明其清除活性氧的能力较强。30℃胁迫时猴头杜鹃的MDA含量增幅较小,但38℃胁迫时其增幅却大于耐热性较弱的井冈山杜鹃,且同一处理间2种杜鹃的MDA含量均差异不显著,说明MDA不宜作为常绿亚属杜鹃耐热性强弱的鉴定指标,这一结果与王凤兰等的报道相似。强烈的蒸腾作用导致体内水分亏缺是植物受高温伤害的重要原因。因此,高温胁迫下渗透调节物质含量的提高对维持植物体内水分平衡和细胞膜结构的稳定性具有重要意义。Pro是一种水溶性极强的氨基酸,可调节原生质体与环境的渗透平衡、缓解细胞因脱水而引起的伤害。大量研究表明,高温逆境下耐热性较强的种Pro增幅大于热敏感种,其含量高低可作为植物耐热性强弱的重要指标。本研究表明,高温胁迫下2种杜鹃叶片的Pro含量均随着温度的升高而增加。30℃时猴头杜鹃Pro增幅较小,可能是相对于耐热性较强的种胁迫强度不够,其体内脯氨酸合成酶类对脯氨酸的反馈抑制能力仍能维持在高水平状态,而38℃重度胁迫时其Pro大量积累,有利于细胞的持水和抵御高温伤害。井冈山杜鹃在30℃胁迫时Pro即大量积累,表明对于耐热性弱的种在30℃时已构成较重的胁迫,而38℃时增幅却较小,且在3个温度条件下其含量均显著低于猴头杜鹃。可见,Pro积累与胁迫程度和植物的耐热性密切相关,耐热性强的种Pro含量高、重度胁迫时增幅大,对抵御高温伤害起到了保护作用,这一结论也与水分胁迫下云锦杜鹃的生理响应一致。可溶性蛋白质也是植物体内的重要渗透调节物质。多数学者发现,高温胁迫下可溶性蛋白质含量随温度升高而增加,从而增强了植物的渗透调节能力,且其含量的变化与植物耐热性呈正相关。李云等发现,热激锻炼能提高菊花幼苗的可溶性蛋白质含量,认为与热激蛋白的诱导合成有关;Harris等发现,在冬季低温时杜鹃出现特异蛋白,并在春季升温时逐渐消失;但也有人认为可溶性蛋白质的积累与品种的耐冷性呈负相关。本研究发现,在高温胁迫下耐热性较弱的井冈山杜鹃可溶性蛋白质含量增幅较大,尤其是38℃胁迫时比对照增加209.44%;而猴头杜鹃可溶性蛋白质不仅在高温胁迫时增幅小,且在3个温度下其含量也相对较低,特别是38℃重度胁迫时其含量和增幅均显著低于井冈山杜鹃。考虑到可溶性蛋白质含量及增幅与2种杜鹃的田间耐热性呈负相关,推测高温胁迫下可溶性蛋白质的积累是对高温伤害的被动响应,反应了植物受环境胁迫的程度和细胞受损伤的大小;但可溶性蛋白质的积累又对细胞膜有一定的保护作用,有利于维持细胞的膨压和减轻高温对植物的伤害。AsA存在于叶绿体基质中,为植物体内重要的非酶促小分子抗氧化物质。它不仅可以还原O-.2、清除·OH、猝灭1O2、歧化H2O2、再生VE,还能调节保护酶活性;高温胁迫下或植物体衰老过程中AsA含量普遍下降,耐热性强的植物在高温下具有较高的AsA含量,说明AsA对减缓和抵御高温伤害具有重要意义。本研究表明,高温胁迫下2种杜鹃叶片AsA含量均随温度升高而降低,但耐热性较弱的井冈山杜鹃降幅较大,尤其是38℃重度胁迫时急剧下降、其含量显著低于耐热性较强的猴头杜鹃,一方面可能是高温抑制了AsA的合成,另一方面可能是高温导致体内活性氧的大量产生,AsA在参与活性氧的猝灭时因消耗而大幅降低;而AsA含量的下降不仅削弱了AsA对活性氧的直接清除能力,也对Halliwell-Asada循环有一定的影响,从而进一步加剧了膜脂过氧化的伤害。因此推测,高温胁迫下AsA含量大幅下降是导致不耐热的井冈山杜鹃活性氧大量积累、细胞膜受害的重要原因,也是检测高温逆境下杜鹃过氧化伤害程度及对高温适应能力的重要指标。云锦杜鹃在重