盐胁迫下甜瓜转录因子表达的表达变化

盐胁迫下甜瓜转录因子表达的表达变化

土壤盐分是一个全球生态环境问题，是植物生长发育和农业生产的主要因素之一（zhang等人，2011）。甜瓜是我国重要的经济栽培作物。葫芦科中,甜瓜的耐盐性仅次于南瓜,但较高的盐分也会对甜瓜栽培造成危害(Botía等2005),如抑制甜瓜生长、影响代谢、降低产量及品质等(Mendlinger和Fossen1993;Franco等1997;Carvaja等1998;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000)。研究甜瓜耐盐机制对于了解作物耐盐性和盐渍化土壤改良具有重要意义。甜瓜耐盐性的研究主要集中生理特性方面,如在盐胁迫下甜瓜的离子浓度、气孔开度、光合能力、抗氧化酶活性等方面(Mendlinger和Paster-nak1992;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000;Rodríguez-López等2000;Sivritepe等2005)。利用分子生物学手段来研究甜瓜盐胁迫下的转录调控鲜有报道。转录调控是植物对逆境胁迫产生应答的关键步骤(Kawaura等2008),转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中有重要作用。当植物受到逆境胁迫时,转录因子会与相应的顺式作用元件结合启动相应基因的转录表达,调控并减轻逆境胁迫给植物带来的伤害(刘强等2000)。研究盐胁迫下植物转录因子表达的特性和规律对揭示植物耐盐机理具有重要意义。转录组研究发现大量转录因子在盐胁迫条件下表达发生变化。利用微阵列技术分析盐胁迫条件下拟南芥转录组的变化,发现有289个转录因子受盐胁迫诱导上调表达,139个转录因子的表达被抑制(Jiang和Deyholos2006)。同样,在苜蓿中发现171个基因被盐胁迫诱导而上调表达,其中20%是转录因子(Gruber等2009)。本研究利用新一代高通量测序手段——转录组测序(RNA-Seq)技术,通过转录组分析来研究不同品种甜瓜叶片中盐胁迫响应转录因子表达特性,以期更好地理解甜瓜对盐胁迫响应的分子机制,增加对作物耐盐机理的认识,并为培育耐盐品种提供参考。材料和方法1试验材料和材料本试验采用2种不同地区的甜瓜(CucumismeloL.)品种‘冰雪脆’(‘BXC’,产地济南,光皮)和‘玉露’(‘YL’,产地台湾,网纹)为试验材料。2基质处理与盐析本试验于上海交通大学农业与生物学院现代农业工程训练中心玻璃温室区进行。选取籽粒饱满、大小一致的种子,浸种催芽后播种于盛有混合基质(蛭石:珍珠岩=1:1)的128孔穴盘中。萌发后每隔2d浇1/2“花无缺”营养液(N:P:K=20:20:20)(上海永通化工有限公司),培养基质含水量维持在相对湿度75%左右。待幼苗长到两叶一心时,移栽到20L的PVC桶中(每桶种1株),所用混合基质为草炭:蛭石:珍珠岩:有机肥=4:4:1:1,测定基质的EC值为1.0,pH为7.03。温室条件为日温24~28℃,夜温18℃;光周期14h·d-1(光照强度大于87.5μmol·m-2·s-1)。以去离子水为对照,用300mmol·L-1浓度的NaCl溶液进行处理。为避免盐冲击效应,采用每天递增75mmol·L-1盐浓度方式处理。达终浓度后每隔2d浇足量终浓度盐溶液,以冲洗基质中残留盐分,保证基质盐浓度在最小的范围内波动。期间视需要同时浇以“花无缺”营养液。每个处理随机取样3株,重复3次。在达到终浓度后第7天时进行叶绿素荧光指标的测定和分析,且取甜瓜叶片经液氮处理并于–80℃下保存备用。3叶片光化学活性测定将各处理植株充分暗适应30min以上,用FMS-2型便携式荧光仪(英国Hansatech公司)在室温下测定每株叶片暗适应下的光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)、初始荧光(F0)和光化学量子效率(ФPSII)。每个指标测定重复6次,取平均值。利用MicrosoftExcel2007整理测定数据,采用SigmaPlot11.0作图,方差分析用SAS9.0处理。4rna提取方法按Trizol试剂盒(Invitrogen公司,美国)说明书提取总RNA,并用RNeasyMini试剂盒(Qiagen公司,荷兰)纯化。用NanoDrop-1000分光光度计测定所抽提RNA样品的A260、A280值,计算样品浓度,并用变性琼脂糖凝胶电泳定性检测所提取RNA的质量。每个处理取3个生物学重复的RNA样品混合为50μL,用于RNA-Seq转录组测序。5转录组测序高质量RNA样品由上海翰宇生物科技有限公司进行测序文库构建,利用IlluminaHiSeq2000高通量测序平台对文库进行转录组测序,具体方法参见Xu等(2012)。利用basecalling将测序后得到的原始图像数据转化为序列数据,即原始序列数据(rawreads)。6差异表达基因的计算用Tophat软件(Trapnell等2009)将去除接头和低质量后得到的Cleanreads比对甜瓜基因组序列(Jordi等2012),随后利用Cufflinks软件(Trapnell等2010)组装比对结果,得到Unigenes,并且根据RPKM(ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads)方法计算样本间的基因表达差异。在本研究中,以B0(‘冰雪脆’,无盐处理)、Y0(‘玉露’,无盐处理)作为对照,将相对应的B2(‘冰雪脆’,300mmol·L-1NaCl处理)、Y2(‘玉露’,300mmol·L-1NaCl处理)符合P<0.05且差异倍数在2倍以上的基因定义为差异表达基因。通过Blast2-GO软件对Cufflinks组装得到的所有Unigenes与NCBI的nr蛋白质序列数据库比对,对Unigene进行功能注释和分类(Conesa等2005)。7荧光定量检测选择差异表达的NAC、WRKY和MYB家族的各2个转录因子,用PrimerPremier5软件设计引物(表1),进行实时荧光定量PCR分析。将各样品次生物学重复的RNA采用第一链cDNA合成试剂盒(Takara公司,日本)反转录为cDNA,以反转录产物为模板,以Actin为内参,采用QIAGEN公司的SYBRGreenRT-PCR试剂盒,利用FTC-3000qPCR系统(FunglynBiotech公司,上海)进行荧光定量检测。各样品每个基因重复3次,按2-uf044uf044Ct相对定量法进行定量计算相对表达量。结果1盐胁迫对‘玉露’和‘冰脆’f0和psiii的影响由图1可以看出,300mmol·L-1NaCl胁迫‘冰雪脆’和‘玉露’后,F0、Fv/Fm和ФPSII值与对照组相比有不同程度的下降。和对照相比,盐胁迫后,‘玉露’的F0由0.7下降到0.65,下降幅度为7.7%;‘冰雪脆’的F0由0.81下降到0.43,下降幅度为47.3%,品种间差异显著。‘玉露’和‘冰雪脆’的Fv/Fm分别在盐胁迫后下降18.01%和47.35%,ФPSII分别下降了15.12%和48.11%。品种间比较可以看出,‘玉露’的F0、Fv/Fm和ФPSII值均高于‘冰雪脆’中的,品种间差异显著。2转录组基因转导率meloc-tki与对照相比,‘玉露’在盐胁迫下共有56个转录因子的转录水平发生了改变。其中,上调表达的转录因子基因22个,上调倍数在7.31~61.82之间,其中最大上调基因为MELO3C020971。转录水平下调表达的有34个,下调倍数在7.89~243.88,其中MELO3C01364基因下调243.88倍。‘冰雪脆’在盐胁迫下与对照相比,共有47个转录因子转录本表达发生变化(表2)。其中,上调表达有17个,上调幅度在6.19~94.35倍之间;下调表达的30个,表达幅度变化在7.16~141.04倍之间。3转录因子基因不同甜瓜品种响应盐胁迫品种响应转录因子的变化表现出品种特异性(图2)。‘玉露’所涉及的56个盐胁迫响应转录因子中有29个基因表现出品种特异性,占总数的51.8%。其中转录水平上调表达的转录因子基因有13个,下调的有16个。‘冰雪脆’在盐胁迫下有20个特异响应的转录因子,占所有应答转录因子基因的42.6%。其中盐胁迫抑制的基因有12个,盐胁迫诱导的有8个。‘玉露’和‘冰雪脆’对盐胁迫共同响应的转录因子有27个,其中有9个为上调表达,18个表现为下调表达。4转录因子家族结果(表3)表明,甜瓜在盐胁迫下有25个转录因子家族的差异表达。其中差异表达显著且包含转录因子数量较多的转录因子数较多的家族有AP2/EREBP、NAC、Homeobox、WRKY、MYB、Zincfinger、Ttcp7/9、bHLH和Gata等。盐胁迫下叶绿素荧光含量变化幅度较小的‘玉露’其表达发生变化的56个转录因子转录本属于19个转录因子家族。表3和4可以看出,NAC家族上调表达的转录因子最多,为6个(27.3%),上调表达幅度最大的是MELO3C017185为61.119倍;Zincfinger家族下调表达转录因子最多,为7个(22.6%)。有的转录因子家族既有转录水平上调的,也有转录水平下调的,如MYB家族、NAC家族和ERF家族。与‘冰雪脆’相比,homeobox-leucinezipperproteinathb-7和heatstresstranscriptionfactorb-3是‘玉露’特有的盐胁迫应答转录因子,并且此两类转录因子主要表现为上调表达。‘冰雪脆’中表达发生变化的转录因子转录本属于20个转录因子家族,其中上调表达幅度最大的是NAC家族的MELO3C017185,表达量上调了94.136倍,下调表达幅度最大的是MYB家族中的MELO3C006313,下调了141.04倍。4个转录因子家族中的转录因子转录本在盐胁迫下转录水平表达上升和下降同时存在,这些家族分别为AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger家族。与‘玉露’相比,‘冰雪脆’特有盐胁迫应答转录因子为HDdomainclass、palmate-likepentafoliata1和mixta-liketranscriptionfactor,并且这些转录因子主要表现为下调表达。‘冰雪脆’和‘玉露’共同上调的转录因子家族有AP2/EREBP、NAC、WRKY和MYB家族;共同下调的转录因子家族有AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger、bHLH、Ttcp7/9、Gata、transcriptionactivatorglk1-like和GRAS,这些共性的转录因子可能是甜瓜耐盐性研究重要的分子线索。5pcr对盐处理前后表达的影响分别选取‘玉露’和‘冰雪脆’中NAC、WRKY和MYB家族的2个基因,利用实时荧光定量PCR对其盐处理前后表达变化进行分析。由荧光定量结果(表5和图3)可以看出,虽然在表达变化幅度上有些差异,但从6个基因的表达趋势来看,实时荧光定量分析结果与转录组分析结果基因的表达趋势基本一致,说明Illumina测序获得的转录组数据的可靠性。盐胁迫反应中anyf转录因子转录调控是植物对逆境胁迫产生应答的关键步骤,转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中发挥重要的作用。目前已经鉴定出AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC以及bZIP/HD-ZIP等转录因子家族的成员参与了植物对盐胁迫的应答反应(朱冬梅等2010),特定转录因子表达水平的变化能极大地影响植物适应逆境的能力。转录因子在盐胁迫下呈现出不同的应答反应模式,表明这些转录因子在盐胁迫应答途径中扮演着不同的角色(Jiang和Deyholos2006;Kawaura等2008;Gruber等2009)。本文研究结果表明,盐胁迫可以诱导或抑制众多转录因子表达,且不同品种甜瓜的转录因子在其转录水平表现出一定的品种特异性。盐胁迫下,两个甜瓜品种‘玉露’和‘冰雪脆’叶片的叶绿素荧光参数相差较大,说明两个品种在耐盐性方面有一定的差异。‘玉露’有51.8%的转录因子是盐胁迫特异响应,‘冰雪脆’中则有42.6%的盐胁迫逆境响应转录因子表现为特异响应。盐胁迫下2种甜瓜品种表现的不同叶绿素荧光参数也体现了2个品种盐胁迫时转录水平调控方式可能有所差异,其盐胁迫的适应机理可能也有所差异。由于转录因子数目众多,其调控方式表现出丰富的多样性,测序数据分析结果也可以看出这两个品种在盐胁迫逆境下,有的转录因子家族中既有上调表达的,也有下调表达。这种表达的差异可能是植物重新组织和调节生理生化活动,以提高或改善某些代谢途径来适应盐逆境胁迫,减少伤害。两种甜瓜在盐胁迫条件下所表达的转录因子也有部分相同,表明其在盐胁迫时有某种相同的反应机制,这种机制可能与基础抗性有关。植物AP2/EREBP转录因子家族能够对包括盐胁迫在内的多种非生物胁迫产生应答(Kizis等2008)。本研究发现甜瓜响应盐胁迫的AP2/EREBP转录因子大部分属于ERFs转录因子家族(ethylene-responsivefactors)。ERF广泛参与植物生长发育及各种逆境胁迫反应的调控(莫纪波等2011)。如对转入ERF类转录因子OPBP1基因的烟草分析发现,OPBP1的过表达能提高烟草的抗盐能力(刘文奇等2002);番茄ERF类转录因子JERF3既是GCC-box结合蛋白,又能识别DRE元件。JERF3在番茄中能被乙烯、茉莉酸、低温、高盐和脱落酸诱导,同时能提高转基因烟草的耐盐性(Wang等2004)。本研究中,部分AP2/EREBP基因参与甜瓜应对盐胁迫的分子调控过程,2种甜瓜中表达发生变化的AP2/EREBP基因大都不同且数量也不同。在‘玉露’中有11个,其中4个上调表达,7个下调表达;‘冰雪脆’中有6个,其中仅有1个表现为上调。在盐胁迫下,一些AP2/EREBP基因表现为上调,而另一部分基因却表现为表达抑制,说明不同的基因参与环境胁迫响应的调节方式不同。近几年,植物ERFs转录因子在基因克隆和功能研究方面取得了很大进展,但目前对ERFs转录因子整体调控机制还不很明确(莫纪波等2011)。ERFs转录因子在植物胁迫应答反应中的深入研究,将为培育耐逆性作物新品种提供参考。植物对逆境胁迫的应答与NAC家族转录因子有密切关系(Purani等2012;Nakashima等2012)。对普通小麦的转录组分析发现53个NAC基因中有23个NAC基因受盐胁迫诱导上调表达(Glenn等1999)。NAC家族基因在拟南芥根部对NaCl应答最为显著,表明它是拟南芥根部对盐胁迫应答反应中潜在的重要调节因子(Vannini等2004;Jiang和Deyholos2006)。本研究也检测到受盐胁迫诱导的NAC类转录因子,在‘玉露’和‘冰雪脆’中上调表达的NAC类转录因子都比下调表达的多,表明这两种甜瓜中NAC转录因子在盐胁迫下主要通过诱导表达起调控作用。植物中对盐胁迫特异性应答以及超高水平应答的NAC转录因子过表达大多能使转基因植物提高一种或几种胁迫耐受性,对植物耐盐基因工程具有重要参考价值(李小兰等2013)。WRKY基因在植物体内的表达受生物和非生物环境的诱导,其表达具有快速、瞬时等特点(Zhou等2008)。在葡萄中,逆境相关的信号物质,如脱落酸、高盐和低温等逆境胁迫均可诱导3个WRKYs基因的表达,表明WRKYs参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程(侯丽霞等2013)。本研究也检测到在盐胁迫下不同甜瓜品种中WRKY均为上调表达,表明它是甜瓜对盐胁迫应答反应中潜在的重要调节因子,主要通过上调表达对作物起