不同方法检测因素检测的基质金属蛋白酶表达比较

不同方法检测因素检测的基质金属蛋白酶表达比较

氨基金属酶-pmp-2和pmp-9是主要的硝基金属酶菌株，与肿瘤浸润和转化之间有着密切的关系。近年来,对MMP-2、MMP-9的研究较为深入和广泛,研究方法也分门别类。就蛋白水平而言,主要实验手段有免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸收检测、胶原底物降解检测、Westernblot印迹、Southwestern印迹、明胶酶谱法等等。各种方法侧重点不尽相同,其中免疫组织化学和免疫荧光重点在蛋白的组织定位和半定量,酶联免疫吸收检测、胶原底物降解检测、Westernblot印迹、Southwestern印迹几种方法在严格控制实验条件的前提下可以做到蛋白定量检测,而明胶酶谱则能够区分酶原和活化酶。若综合考虑实验设备、技术手段、经费预算等多方面因素,最常用的还是免疫组化、免疫荧光、胶原底物降解、明胶酶谱几种方法。本研究分别采用免疫组化、明胶酶谱、Westernblot三种方法检测MMP-2、MMP-9的活性,评价三种方法检测MMP-2、MMP-9表达的优点与局限性,为更加客观准确的反映各型肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的实际表达,探讨出一种经济、快速、准确的检测手段。1材料和方法1.1手术切除新鲜组织选择四川省医学科学院·四川省人民医院口腔颌面外科及四川大学华西口腔医学院颌面外科涎腺肿瘤患者手术切除新鲜组织,其中良性肿瘤26例(基底细胞腺瘤3例、肌上皮瘤3例、多形性腺瘤20例),恶性8例(黏液表皮样癌、腺样囊性癌各2例,腺泡细胞癌、恶性肌上皮瘤各1例,低分化腺癌2例)。排除复发涎腺肿瘤和术前曾接受抗肿瘤治疗的患者。1.2方法1.2.1免疫组化sp法1.2.2明胶酶谱法1.2.3网络盾1.3评估的结果1.3.1染色阳性细胞数参考Nagel的方法并加以改良进行计分,无阳性细胞为阴性,记为0;染色阳性细胞数<10%记为1分;10%～50%记为2分;>50%记为3分。1.3.2检测积分光密度4500000像素数码照相机拍照,imageproplus4.10版本的专业图像分析软件进行图像分析,记录积分光密度IOD。1.4统计方法以SPSS10.0统计学软件处理数据,采用Mann-Whitney检验和Logistic回归分析。2结果2.1免疫组化2.2明胶酶谱2.3网络盾2.4三种方法的结果的比较3活性mmps酶原蛋白及活性酶原活性分子的活性迄今为止,免疫组化方法仍是原位检测组织蛋白最直观、应用最广的方法,在检测基质金属蛋白酶蛋白的实验中,它不仅提供了各型肿瘤间、各种因子间半定量的比较数据,更重要的是做到了组织定位,从形态学上反映了MMPs的表达规律。如黏液表皮样癌中MMPs主要表达在表皮样细胞和中间细胞,黏液细胞着色少;腺样囊性癌中,条索状实性区域上皮细胞表达强于腺管-筛孔样区域。根据组织学分级,黏液细胞分化相对成熟,而表皮样细胞和中间细胞分化较低,显示了较强的生长活性。该结果支持Ross的结论:中间细胞是黏液表皮样癌中最具侵袭性的细胞。多数学者认为腺样囊性癌中实性条索样区域较腺管和筛孔样区域浸润性更强,本研究中也显示MMPs在这些区域中的表达更强。这些细胞定位特征提示了MMPs在涎腺恶性肿瘤浸润、侵袭过程中的重要作用。但由于实验中主观因素干扰较多,如阳性信号的强弱受室温、空气湿度、溶液离子浓度等非控制因素的影响,各批次着色程度差异较大,另外阳性判断也因主观认识不一而有所差异,故免疫组织化学只能对所检测蛋白的表达强弱进行半定量比较。本实验辅以Westernblot定量方法进行补充,使设计更加严谨,结果更加可信。明胶酶谱法是一种区分酶原和活性酶的特异性方法。MMP-2、MMP-9都是以酶原形式分泌,在细胞外环境中其N末端-肽段被切下来后即转变为活性形式。实验中运用非还原SDS电泳,利用MMPs与阴离子去垢剂SDS结合,形成蛋白质-SDS复合物,使待测蛋白质带上相同的负电荷,其量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别,此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量。SDS电泳后,将分子量不同的MMPs及与MMPs结合的组织抑制剂同时分离,再用阳离子去垢剂(Trtion-X100)除去SDS,这一过程中引发了MMPs酶原蛋白体外活化机制,酶原在凝胶内除掉一个约10×103KDa的小肽,转变为有活性的酶,降解凝胶中相应部位的明胶。体内已被纤溶酶等物质激活的活性MMPs,在除掉SDS后也可以恢复酶活性,在酶谱上称之为活性型MMPs,可在比酶原分子量小10×103KDa处留下白色透明条带,从而与酶原相区别。活性酶在体内才具有水解胶原等基质的作用,因而在功能上的意义要大于相应的酶原。本研究免疫组化结果显示恶性涎腺肿瘤中MMP-2的表达强于良性肿瘤,明胶酶谱实验则进一步证实是活性MMP-2表达不同导致这一差异,MMP-2酶原的分泌量在二者间差异是不明显的,这也更加清晰的显示在恶性肿瘤中MMP-2通过增加激活量促进了肿瘤细胞的侵袭、转移。MMP-9在恶性涎腺肿瘤中的表达强于良性肿瘤,但免疫组化实验不能发现统计学上的差异。明胶酶谱法显示:不仅活性MMP-9而且MMP-9酶原的分泌在二者也有重要差异,证实MMP-9同样参与了肿瘤组织降解细胞外基质、开辟浸润、转移通道的过程。此外,酶谱实验还显示了部分恶性涎腺肿瘤中中间型MMP-2的表达,在MMP-2酶原的激活过程中,中间型MMP-2相当于一个储备库,维持活性型MMP-2的高浓度,不因MMP-2酶原的量暂时变化而影响最终活性酶的浓度,维持了细胞外基质的降解速率。本实验在涎腺良性肿瘤中未发现中间型MMP-2表达,而一些恶性肿瘤中能检测到其存在,说明随着涎腺恶性肿瘤持续生长,作为活性酶的储备库中间型MMP-2将不断转化为活性MMP-2,使活性酶持续增高或维持在一个相对较高的水平,令细胞外基质持续降解。综上所述,免疫组化、Westernblot、明胶酶谱三种方法结合既发挥了免疫组化细胞定位的优势,打破其不能辨别酶原与活性酶的局限性,又克服了免疫组化法半定量的局限性,能更加客观准确反映各型肿瘤组织中MMP-2、9的实际表达,是一种可行的三联检测手段。将免疫组化所测的MMP-2计分值与Westernblot法测得的IOD值标准化后进行比较,得到图4的分布趋势,Westernblot与免疫组化检测的MMP-2表达强度一致。Westernblot是定量检测,免疫组化是半定量检测,二者趋势一致说明免疫组化实验所得数据是真实可信的。免疫组化实验不能检测出涎腺良恶性肿瘤间MMP-9的表达差异,明胶酶谱法不但能检出总MMP-9的差异,还能检出MMP-9酶原、活性MMP-9的差异。从图5可以看出,MMP-2、MMP-9在涎腺良恶性肿瘤中表达不同主要是由于活性MMP-2、MMP-9表达不同所造成。受所购抗体适用范围的限制,本实验只对34例涎腺肿瘤进行MMP-2的Westernblot检测。得到的PVDF膜在相应分子量区域(72KDa)见一条长方形棕黄色抗原条带,即为所检测的MMP-2组织蛋白条带(图3)。由于转移过程中蛋白浓度减少,故膜上的显色条带较浅,肌上皮瘤、基底细胞腺瘤的有些条带肉眼几乎不能辨认,通过计算机成像分析才能检测到。良恶性肿瘤间MMP-2的表达存在差异(P=0.029)。从上到下观察得到的蓝色背景凝胶块,可以看到五条带:分子量92KDa的MMP-9酶原;分子量83KDa的活性MMP-9;72KDa的MMP-2酶原;64KDa的中间型MMP-2,是去除了8KDa的肽段,但未完全激活,只有低分化腺癌(IOD值42570.91)、黏液表皮样癌(IOD值32127.23)和腺样囊性癌(IOD值41998.50)有所表达;62KDa的活性MMP-2条带(见图2)。MMP-2酶原在全部样本中都有较强表达(表2),良性、恶性肿瘤间差异不明显(U=22.500,P=0.52)。活性MMP-2在所有样本都有一定表达,恶性肿瘤的表达水平高于良性肿瘤(U=9.500,P=0.011)。MMP-9酶原、活性MMP-9在大部分良性肿瘤中表达很低或缺失,在恶性肿瘤中均有明确表达(U=0.000、U=2.500,P=0.031、P=0.022)。部分低分化腺癌和腺样囊性癌中,在MMP-2酶原和活性MMP-2带间可见一条微弱的64KDa透明条带,颜色较浅,即为中间型MMP-2。阳性信号呈棕色细颗粒状,定位于肿瘤细胞胞浆内,镜下积分结果见表1。MMP-2在全部34例肿瘤中有不同程度表达(34/34),良性肿瘤中MMP-9呈阴性(肌上皮瘤1/3,基底细胞腺瘤2/3)。按前述标准计分后进行统计学分析,发现涎腺恶性肿瘤MMP-2的表达强于良性肿瘤(U=3.000,P=0.018);MMP-9在恶性肿瘤中的表达(均值1.556)也高于良性肿瘤(均值0.667),但二者间差异无统计学意义(U=23.000,P=0.069)见图1。黏液表皮样癌中MMPs因肿瘤细胞种类不同而表达不同:表皮样细胞和中间细胞表达较高(均值2),黏液细胞表达很少(均值1);腺样囊性癌中MMPs在不同的组织结构区域其表达也不相同:条索实性区域上皮细胞(均值2)表达强于腺管-筛孔样区域(均值1.5)。单克隆抗体MMP-2、MMP-9,SP试剂盒购自ZYMED公司(1∶100)。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复,10%正常羊血清孵育,滴加一抗,4℃冰箱中过夜,PBS缓冲液(Na2HPO48.1mmol/L,KH2PO41.5mmol/L,NaCl137mmol/L,2.7mmol/LpH7.4)振荡清洗后分别滴加二、三抗,DAB显色,苏木素复染,常规封片。标本离体后-70℃冰箱内保存。常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液,提取上样于含0.1%明胶的7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS电泳,分子量Marker采用低分子量蛋白标准品。电泳结束后将胶体置于洗脱液(2.5%TritonX-100)中震荡洗涤;明胶缓冲液(50mM/LTris,100mM/LCaCl2,200mM/LNaCl,1μM/LZnCl2)37℃孵育18小时,此步骤为证实反应产物确为MMP-2、MMP-9,可分别在明胶缓冲液中加入其非特异性抑制剂EDTA20mmol/L、特异性抑制剂苯甲基磺酰胺20mmol/L,以明确所得条带的性质,同法孵育。孵育结束后考马斯亮蓝溶液染色1小时,脱色约30～40分钟,得到蓝色背景上的透亮带同明胶酶谱法制备组织蛋白抽提液,提取上样于8%聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS电泳,半干