454测序系统在生物学中的应用

454测序系统在生物学中的应用

20世纪70年代，圣吉发明的双脱氧法在过去30年中一直发挥着主导作用。根据双脱氧测序法的基本原理,国际人类基因测序小组和塞莱拉基因组公司分别完成了人类基因组的测序工作,并在此过程中完善和发展了双脱氧测序技术[2~4]。尽管传统测序技术相对成熟且完善,但要进行大规模测序其价格还是比较昂贵。同时传统方法对完整基因组测序的速度慢,获取的信息量小,满足不了目前研究的需要。加之为了实现1000美元测序一个基因组的长期目标,诸多生物技术公司开发了各种类型的测序技术,统称新一代测序技术,如454生命科学公司推出的454测序技术、Illumina公司和ABI公司相继推出的Solexa和SOLid测序技术等,其中,最早实现商业化运营的是454测序系统。新一代测序技术不仅在重复序列较少的微生物基因组测序中应用,在含有大量重复序列的真核生物基因组(如大麦)测序方面也展现了其优越的性能。在植物转录组研究方面,新一代测序系统的应用显示了极大的潜力,被广泛应用于新基因的发现、SNP及分子标记的挖掘、基因家族鉴定及进化分析、转录图谱绘制、代谢途径确定等方面。本文就新一代测序技术的原理及其在植物转录组研究中的应用进行如下综述。1开发现代系统1.1454个测量系统1.2快速测序测试数据Illumina的Solexa平台最早是由Turcatti及其同事开发的。这个平台到目前为止发展出4种商业化的型号,分别是GenomeAnalyzer、HiSeq1000、HiSeq2000和MiSeq。早期的GenomeAnalyzer可以测得2×150bp的片段,运行14d时间得到85到95Gb的数据。通过改进仪器和试剂,目前的HiSeq1000和HiSeq2000测序仪,在使用TruSeqV3试剂盒时,可以在一次运行中分别获得30亿和60亿条序列,所得数据达到270~300Gb和540~600Gb。MiSeq测序仪则是一款适合单个实验室和小型项目的测序仪,可以在几小时内获得结果,每次运行能产生超过1Gb的数据,使得测序更方便快速。1.3abi公司的solid4测序平台ABI公司的SOLiD测序平台是由McKernan及其同事于2006年开发的。2008年,SOLiD3测序平台就在人类基因组测序领域使用,花费低于6万美元。在2009年的一次运行中,SOLiD3测序平台获得了超过50Gb的数据。2010年初,ABI公司推出了SOLiD4测序平台,可在一次运行中测得100Gb的数据,而测一个基因组的花费为大约6000美元。2010年底,ABI公司推出了最新的测序平台SOLiD5500xl。使用纳米小球的SOLiD5500xl平台可以在一天内测得30~45Gb的数据,一次运行测完3个基因组或40个外显子组或20个转录组,获得300Gb的测序数据。2开发与设计平台的原理、方法和优势2.14hesh,cs反应2005年,罗氏454测序公司首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统,开创了第二代测序技术的先河。该技术是通过合成反应而测序(Seqencing-by-synthesis,SBS)的原理进行测序的。此过程共有4种酶参与反应:DNA聚合酶,三磷酸腺苷硫酸化酶,荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。具体原理是:在DNA链合成时,如以下反应式所示:(NNN)n+NTP→(NNN)n+1+PPi,每向DNA链上增加一个碱基,则会释放出一分子的焦磷酸。焦磷酸可在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下转化为ATP,生成的ATP则可在荧光素酶的催化下与虫荧光素反应发光。因此,通过为反应体系中依次添加4种不同的NTP底物,用光电倍增管或电荷耦合装置测定到添加何种NTP时有荧光发出,则可推知在新生成的DNA链上所增加的是何种碱基。2.2聚簇形成测序Illumina平台测序时所需的文库,可以使用任意能产生数百碱基长、两翼有接头的片段的方法构建。通过PCR桥,生成扩增的序列。正向和反向PCR引物都被一个有弹性的链接物链接到一个固体底物上,这样一来,所有新生成的扩增子被固定住并在阵列上形成聚簇。与传统的PCR桥不同的是,这里使用Bst聚合酶进行延伸,并使用甲酰胺变性。生成的每个聚簇都包含有1000个以上的克隆扩增子。在一个流动池的8条道上,数百万的聚簇被扩增到可辨别的位点上。聚簇生成后,扩增子被线性化(单链化),测序引物会结合到目标区域两侧的通用序列上。测序的每一个循环包含了在DNA多聚酶和4种核苷酸条件下的单个碱基延伸。这些核苷酸通过两种方式修饰。他们是“反向终止子”,3′羟基位置上的切除使得每循环中只有一个碱基被暴露出来,之后4种可变化学剪切到的荧光染料中的一种与之结合。在单个碱基延伸和通过4通道图像收集后,用化学方法切除掉两个可切除的集团,进行下一轮的反应。2.3荧光标记的pcr和测序SOLiD平台的测序原理是边合成边测序,使用DNA连接酶驱动反应进行。该平台测序所需的文库是短的、两翼有接头的片段混合物。通过emPCR生成克隆测序序列,之后扩增元被捕获到1uf06dmol/L的强磁性小球表面。emPCR结束后,小球所带的扩增产物被选择性地回收,接着被固定到一个固体平板上,形成一个随机的大密度阵列。一个与接头序列互补的通用引物与阵列中小球上相连的扩增元杂交。每一轮循环包含荧光标记的八聚体连接。这些八聚体的结构经过处理,使得每个荧光标记会与特定的序列位点所结合。连接后,荧光信号会被收集,然后八聚体结构会在5,6位核苷酸之间切除,移除荧光标签。接着进行下一轮反应,测得5个碱基后的第10个碱基的荧光信号,如此循环。测完序列后解离八聚体。之后重新构造八聚体,使得荧光标记标记到不同的位置。再次测序,往复数次,可以测完所有的序列。而且由于每一个碱基被测过两遍,所以准确性会比较高。2.4采用预冷剂的方法在测序过程中,构建一个优质的文库是很重要的,因为文库构建中的任何差错,都可能导致测序出错或失败,从而浪费试剂和时间。对于高通量测序而言,非常需要有既经济又可靠的文库构建方法,同时这些方法需要尽可能的快速,操作方便而且重复性好。对于454GSFLX平台,Lundin等发明了一种方法,该方法的原理是使用泛羧酸包裹的超磁力小球和聚乙烯乙二醇沉淀。作为可重复的和灵活的方法使得DNA片段长度分离。通过该方法很容易产生合适长度的DNA片段。与传统的文库构建方法相比,该方法表现出更高的生成量,通读量和更好的可重复性。对于SOLiD平台,Farias-Hesson等发明了一种半自动的文库制备方法,使用液体处理机器人连接羧基终止的磁性小球。通过特异的6碱基长DNA条形码标记文库样本。采用这种方法,可在17h之内制备好32个用于emPCR或高通量DNA测序的DNA文库。在Illumina平台,Sengupta等发明了一种从10ng总RNA中建立高质量mRNA文库的方法。这种新方法与现有方法相比有很大的优势。它不仅可以从痕量总RNA中建立起一个线性扩增的序列文库,还可以对从多种渠道所得的样品进行对比。此外,这项技术不单可以在Solexa平台上使用,也可以很方便地应用于其他测序平台的文库构建。2.5本文以454ssvx系统为例，介绍了具体的过程顺序2.5.1材料片段化和多态性454测序的可用材料有基因组DNA、PCR产物、BACs和cDNA,非编码RNA等。对于大片段的材料,如cDNA和BACs等,需要被切成300bp到800bp的小片段。而小片段材料,如PCR产物和非编码RNA,则可以直接用于测序反应。在材料片段化之后,对每一个材料片段,在其两端都会加上特异的3′端与5′端连接短接头序列。连接上特异短接头序列的片段就构成了一个模板文库。这些接头序列可在纯化,扩增与测序等步骤中发挥作用。2.5.2在油体系中的乳化结果文库中的每一条片段都单独地被连接到一个经过特殊设计的DNA琼脂糖小球上,然后连接在数以百万计数的小球上的整个文库(由百万计数的片段组成)在油水混合物中与扩增反应物被一同乳化。乳化结果是每一个连接DNA片段的小球形成一个微反应器,在其表面进行PCR与测序反应。乳化之后,用变性剂处理小球,以去除未连接的DNA片段。在emPCR时,文库中所有的片段都平行的进行扩增。对于每一个单独的片段,扩增的结果是在其微反应器上产生百万条扩增。2.5.3微反应器上的小鼠连接有扩增元的微反应器会经过Bst多聚酶和单链结合蛋白预处理,之后被沉淀到特制的PicoTiter板上进行测序。PicoTiter板上有许多的小孔,这些小孔的直径刚好可容纳一个微反应器,这样可以保证生化反应的条件一致性。在加入测序必须的酶(如ATP磺化酶和荧光素酶)之后,FLX测序仪上的流体力学子系统会使单个的核苷酸按照固定的顺序流过含有微反应器的小孔,在ATP磺化酶和荧光素酶的催化下,焦磷酸的释放会立即转化为光信号,这个光信号会被FLX系统的CCD相机记录下来,形成初步的测序数据。2.5.4测序评估和数据库的开发测序产生的初步数据包括信号强度和位置信息。GS系统软件可以跟踪定位携带DNA的琼脂糖小球在XY轴上的位置。每一个小球都会在其对应位置上产生一系列的图像。每个小球在每次核苷酸流过时产生的信号强度都会被记录并且生成一个核苷酸流统计表。每个GSFLX系列的测序仪在10h的测序运行中都会生成超过一百万个核苷酸流统计表,而GSJunior系列测序仪生成大约10万个统计表,每个统计表对应一个拷贝。为了进行有效而准确的测序数据分析,共有3种生物信息学软件被开发使用以分别对应以下3种需求:从头组装成超过400bp的碱基片段;对任何大小的基因组进行重新测序;与已知序列进行比对而寻找探测突变体。2.6系统可靠性分析与传统的Sanger测序技术相比,新一代测序系统具有高通量、低价格的特点。通过表1可以看出,与SOLiD技术和Illumina技术相比,454测序系统具有更长的通读片段和更短的反应时间。并可以进行从头合成测序(denovosequencing)特别是对具有配对末端的片段进行测序。454测序系统单一拷贝的准确率高于99.5%。每运行一次可测序超过4×109到6×109亿bp,得到超过1×106个拷贝,获得约40GB的数据。由于在单个循环中缺乏阻止碱基连续结合的机制,454测序系统的主要缺陷是容易生成同源多聚体。同源多聚体的生成,导致了碱基插入或缺失突变的出现,这也是454测序系统所产生误差的最主要类型。生成的同源多聚物长度可根据信号强度进行推断。经济方面,454测序系统与Illumina和SOLid测序技术相比,每个碱基的测序花费相对较高。从技术角度来讲,对于有参比基因的转录组测序,采用IlluminaGA平台更加经济;如果没有参比基因,使用RocheGSFLX平台可减少拼接难度。345转录组contig转录组是指在一个生物体中所有基因表达后产物的总和。在真核生物基因组研究中,由于少测序了内含子等序列,与测序全基因组相比,测序转录组有无可比拟的经济优势。同时,由于表达谱通过蛋白质直接控制细胞功能,通过表达谱质和量的变化,可以确定特定基因表达的出现或消失,转录组是功能基因组研究的一个重要功能指标。利用454测序系统测序植物转录组,可以得到大量的表达序列标签(Expressedsequencetag,EST)。EST是cDNA的一个片段,通常长度在150~400bp之间。研究人员可以通过连接两端有相同序列的EST,获得一个contig,直至全长cDNA序列。通过对这些EST序列与已知数据库进行生物信息学分析比较,可以进行如下研究。3.1转录组测序和基因表达谱的构建大规模转录组测序的主要目标是鉴定、获得某个生物体或其某个组织表达的全部基因序列。首先,要从生物体的一个组织或几个组织中提取RNA,这些组织可能来自于生物体发育的特定阶段或者是经过特殊处理的生物个体(经过光、温度、水分或营养胁迫处理,基因过量表达或敲除等)。其次,对这些RNA进行测序,通过与数据库中的已知序列进行比对,研究人员常常可以发现新基因,或特定的表达谱。研究人员利用454测序系统对模式植物拟南芥转录组进行重测序,发现与传统测序技术所得的序列相比,454测序系统检测出更多基因座位上的转录本,虽然基因的数量增加不多(10%),但使整体序列覆盖度增加了50%。在Weber等的实验数据中有超过16000个ESTs没有出现在以前的EST数据库中,这些研究说明454测序系统可以胜任植物转录组深度测序的工作,在转录组测序方面具有可靠性和潜力。Cheung等运用GS20系统对非模式植物蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)的EST进行了测序,发现通过454测序得到的序列可以更多的比对到基因上。尽管生成的EST片段比传统方法生成的短,但通过454测序得到的序列同样可以对特定基因进行定位。对于没有完整基因组信息的非模式生物来讲,利用新一代测序技术对转录本进行测序分析对于新基因的发现和基因表达分析都是极其重要的。Sato等使用传统的Sanger方法和结合454测序平台对麻疯树(JatrophacurcasL.)的转录组进行了测序。非冗余序列总长为285858490bp,包含120586个Contig和29831个Singlet。以上数据覆盖约95%的基因区,其G+C含量平均为34.3%。推测其中有编码完整或部分蛋白的基因40929个。并发现有1529个假定编码蛋白的基因是大戟科所特有的。研究所得数据已建立数据库可供查询。因为麻疯树在生物燃料领域的潜在价值,这项研究具有相当的经济意义。目前,研究人员利用454测序系统在对黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)、油橄榄(OleaeuropaeaL.)、玉米(ZeamaysL.)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)、毛花雀稗(PaspalumdilatatumPoir)和珊状臂形草(BrachiariabrizanthaStapf.)等植物的转录组研究中发现了新基因的存在。在表达谱构建方面,454测序系统也有着广泛的应用。李滢等利用454GSFLXTitanium对2年生丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)根的转录组进行测序,研究其基因表达谱,挖掘功能基因。获得46722EST,平均长度414bp。所得序列与GenBank中的丹参EST合并拼接,获得18235条unigene,其中新发现的EST多达13980条。通过BLAST与GeneOntology分析获得了可能参与丹参酮合成的序列27条,参与丹酚酸合成的序列29条,细胞色素P450序列70条,转录因子序列577条。454高通量测序技术作为药用植物功能基因组研究的重要手段在这项研究中发挥了重要作用。此外,研究人员利用454测序平台构建了复苏植物在干旱条件下的表达谱及植物在抗除草剂条件下的表达谱[26~28]等。3.2转录组测序对snp浓度和测序的影响分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。简单重复序列(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)是两类常用的分子标记,其中SNP被称为第三代分子标记,具有广阔的应用前景。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,利用其作为分子标记可以精细到用于区分两个生物个体遗传物质的不同。利用454测序系统并结合各种生物信息学方法,研究人员在不同的植物体内检测到了大量的SNP和SSR。Novaes等对巨桉(E.grandis)转录组以及Cogan等对黑麦草(LoliumperenneL.)转录组,Barbazuk等在对两个玉米品系的茎尖顶端分生组织转录组的研究中都检测到大量的SNP存在。在Barbazuk等的研究中,采用了一种改进的基于贝叶斯多态性检验检测系统的生物信息学工具对SNP进行了检测。从B73品系所得的26000条EST和Mo17品系所得的280000条EST中推测到了SNP的存在。在B73基因组的9980个特异基因中,检测到了超过36000个推测的SNP。采用更严格的条件后使这个数字缩小到超过7000条。其检测到的SNP有超过85%用Sanger测序法得到了验证。这个结果说明基于454测序系统的转录组测序是一个大量挖掘SNP的极佳方法,但获得SNP的数量多少与生物信息学工具检测条件设置的严格与否直接相关。Parchman等在对海滩松(PinusContortaDougl.)转录组的研究中得到了数以千计可被用做分子标记的SNP和SSR,并为大量SSR位点设计出高质量的可在起始过程中被扩增的PCR引物。Guo等在对黄瓜(CucumissativusL.)花蕾转录组的研究中得到一组SSR标记和高可信度的SNP。对于SSR标记而言,用于其序列检测和引物设计的生物信息学工具为QDD程序,该程序可以执行以下任务:标签分类,受体/载体移除,冗余序列去除,可能的基因组多拷贝检测(重复位点或转座子元件),严格条件下的目标微卫星序列选择和定制引物设计。此程序可以在一次特征分类过程中完成一百万条有数百碱基对的序列处理,也可在一个文件夹中对50000条序列进行处理,包括相似性比较。Schafleitner等通过结合Sanger方法和454方法对番薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam)的转录组进行了测序。在该研究中,研究人员共获得524209个reads,经过拼接注释后,在所得结果中鉴定出1661个微卫星序列。选出223个序列进行测试,其中195个序列被成功扩增出来。Shu等比较了不同大豆(Giycinemax(L)Merrill)种系间利用454测序系统测序所得的转录组,鉴定出3899个SNP。发现这些SNP广泛分布于大豆基因组中,涉及各种生理生化过程,影响众多基因调控的重要农艺性状。例如位于基因Glyma07g034903′-UTR的分子标记CAPS282与大豆的百粒重相关。3.3细胞转录组分析GSFLX系统是一个可以对双标签进行有效高通量直接测序的理想平台。其所得数据可以被用于基因表达系列分析(SAGE)。SAGE可以对不同生理和病理状态下的细胞转录组情况进行准确的定性与定量分析。通过提供超过75bp的拷贝序列,研究人员利用SuperSAGE技术可以得到高质量的基因表达谱。利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。由于结合了SAGE技术的高通量以及EST测序的准确性,大规模平行测序会对表达图谱绘制研究起很大作用。Alagna等对2种橄榄(O.europaea)的转录组进行了测序,所得的比较转录组表达谱可鉴别特定代谢过程中的差异表达基因。3.4地位及代谢途径在生物体内,各种酶催化着生理生化反应。根据转录组EST测序结果,可知道在不同生理时期及不同组织内各种酶含量的多少,据此可建立出相关物质的代谢途径。由于454测序的高通量,可以大规模的对生物体组织样本进行测序分析,有利于建立特定时空条件下的物质代谢途径。Sun等利用454测序系统对西洋参(PanaxquinquefoliusL.)转录组进行测序,以期揭示西洋参中人参皂苷的合成途径。在该研究中,454测序产生了209747条高质量的序列,平均长度为427个碱基,从头组装产生了31088个特异序列。KEGG分析确定有4097条序列被定位到特定的代谢途径中。研究人员发现了从乙酰辅酶A开始经过类异戊二烯途径的所有参与人参皂苷骨架合成的酶。另外,有150个细胞色素P450(CYP450)和235个糖基转移酶序列被发现,其中一些编码了负责将人参皂苷骨架转变为其它人参皂苷的酶。表明基于454测序系统的转录组分析在非模式植物次生代谢研究中具有重要意义。目前,已有多种植物通过454测序取得了大量的EST序列数据,可以进一步确定其次生代谢途径。包括黃花蒿(A.annua)中的青蒿素、毛花雀稗(P.dilatatum)和珊状臂形草(B.brizantha)中的木质素、箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.EtZucc.)Maxim.)中的类黄酮、罂粟(PapaversomniferumL.)中的生物碱、苦瓜(MomordicacharantiaL.)中的桐酸、蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.exMurray)Trev.)和龙骨马尾杉(Phlegmariuruscarinatus(Desv.exPoir.)Ching.)中的石松生物碱、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)中的甘草皂苷、东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb.etZucc.)中的紫杉醇等。3.5转录组的聚类分析和测序随着分子生物技术的发展,科研人员开始试图从分子层面解释生物进化问题。由于采用的方法是比较不同生物基因组的差别,因此进行比较的前提条件是大规模收集亲缘关系相近的陆地植物基因组数据。而首先收集转录组数据是非常有用的:首先在经济上比较合算,其次转录组是编码蛋白质的基因区域,最后测序所得数据也为未来的基因组测序提供一定的数据参考。Timme和Delwiche利用Sanger技术与454测序系统结合的方法对圆形鞘毛藻(ColeochaeteorbicularisL.)和草原水绵(SpirogyrapratensisL.)转录组进行测序,通过聚类分析分别得到了12000条草原水绵基因片段和19000条圆形鞘毛藻的unigene。与其他自养的绿藻相比,两者的转录组都非常的‘植物化’。BLAST结果显示这两种植物与几种假设的在进化过程中很重要的陆生植物在转录组水平上高度的相似。这项工作显示了454测序系统在分子进化研究领域的巨大潜力。3.6新一代测序所得的srna数据的发现和研究随着新一代测序技术的发展,对sRNA的研究水平也得到了很大提高。测序所得的海量数据向研究人员揭示了一个异常复杂的sRNA世界,说明植物中的sRNA并非仅微小RNA,天然反义siRNAs以及反式作用siRNAs等几种,还有大量的新的sRNA等待研究人员去发现和研究。毫无疑问,分析现有的通过新一代测序所得的sRNA数据是一条研究sRNA的捷径。Chen等分析了现有的通过NGS测序所得的26种显花植物的sRNA数据。他们发现一些24碱基长的sRNA在转座子沉默过程中起到关键作用。同时功能分析显示这些sRNA在显花植物中是保守的。另外,还有一些miRNA家族也被证明是保守的,例如mi