杜仲叶中绿原酸微波辅助提取工艺研究

杜仲叶中绿原酸微波辅助提取工艺研究

绿色原酸（也称为三-冠朱酸）是由咖啡因和糊精酸组成的缩写酚酸。这是植物通过氧气、呼吸过程中从植物身上释放的一种苯丙素类化合物。绿原酸是一种具有广泛生理活性的物质,有利胆、抗菌、降压、增加白血球及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、清除自由基等多种药理作用,对消化、血液和生殖系统疾病均有显著疗效[2~5]。杜仲(EucommiaulmoidesOliver),古称“曼榆”,又名“木棉”,属杜仲科落叶乔木,为我国特有的经济树种。我国杜仲资源丰富,产地分布全国,总量占世界的90%以上。现代药理研究表明,杜仲含许多药用有效成分,如绿原酸、生物碱、类黄酮、微量元素、维生素等,但杜仲皮的资源短缺,杜仲叶资源丰富且与皮具有相近的化学成分和药理作用,因此对杜仲叶中绿原酸等有效活性成分进行研究具有极其重要的实际意义。高速逆流色谱(HSCCC)是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系,利用溶质在2种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同,从而实现样品的分离。与传统柱层析法相比,高速逆流色谱具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点。根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品,若与制备液相色谱结合,则可快速、大量制备相应纯度的标准品。近20年来,高速逆流色谱在天然产物分离纯化方面已得到广泛应用,可有效地分离提取黄酮类、生物碱类、蒽醌类、皂苷类及多酚类化合物等。目前,较多学者对杜仲叶中绿原酸、类黄酮等主要活性成分的研究仅停留在粗提物的提取工艺、组分检测等方面。本文优化了杜仲叶中绿原酸提取工艺,通过高速逆流色谱一步分离纯化得高纯度绿原酸的试验条件,并通过薄层色谱法、紫外光谱分析、HPLC-MS联用技术结合核磁共振技术对化合物进行鉴定,为杜仲叶活性物质的分离提供有效方法。1材料和方法1.1黄粱梦碱的叶、黄树叶片、小环黄汁杜仲叶于2009年采自衢州,由浙江中医药研究院王茵研究员鉴定为杜仲(EucommiaulmoidesOliver)的叶。杜仲叶晾干,粉碎后过60目筛,备用。芦丁标样与绿原酸均购自中国生物制品检定所,批号分别为100080-200707和110753-200413。HPLC使用进口色谱纯甲醇,Burcick&Jackson公司出产;娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯,由国药集团化学有限公司出产。1.2高效液相色谱仪TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司),N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);Waterse2695SeparationsModule,Waters2996PhotodiodeArrayDetector高效液相色谱仪(美国Waters公司);6210Time-of-Flight离子阱质谱仪(美国Agilent公司);BrukerAvancedmx500超导核磁共振仪(瑞士布鲁克公司);Mas-2微波萃取仪(上海新仪微波化学技术科技有限公司)。1.3萃取方法和溶剂选择采用直接溶剂浸提法与微波辅助溶剂提取法提取杜仲叶中主要活性成分。1.3.1丙酮和乙醇浸提液制备精确称取样品5.0g,溶剂为50%丙酮水溶液和50%乙醇水溶液,料液比1∶30,温度50℃,浸提时间2h,浸提2次。每试验平行进行3次。1.3.2乙醇提取物的制备精确称取样品5.0g,溶剂为50%丙酮水溶液和50%乙醇水溶液,料液比1∶30,提取时间25min,提取温度为50℃,提取功率为400W,提取2次。每试验平行进行3次。1.4因素水平的确定精确称取样品,溶剂为50%丙酮水溶液,采用L9(34)正交表,以浸提温度、时间、料液比和提取功率为4因素建立正交试验,因素水平见表1。1.5绿色原酸含量和提取率的测定1.5.1标准曲线的绘制精确称取5.4mg绿原酸标品,甲醇定容至10ml,备用。分别精密吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2ml,甲醇再次定容至10ml,摇匀。采用HPLC峰面积法,以绿原酸色谱峰面积(Y)对质量浓度(X)绘制标准曲线。HPLC条件:SymmetryshieldRP18色谱柱(4.6×250mm,5μm);柱温35℃;流动相:A为甲醇,B为0.5%的磷酸水溶液,线性梯度洗脱:0~5min:A=30%,5~15min:A:30%~40%;流速0.6ml/min;进样量为10μl;在329nm下测定峰面积。1.5.2峰面积的测定取1.0ml澄清粗提液在50℃下旋转蒸干,甲醇定容于10ml,按上述条件进行HPLC,测定峰面积。根据标准曲线对应的回归方程计算粗提物中的绿原酸含量。1.5.3提取率计算式中,n为稀释倍数,m为杜仲叶质量(g)。1.5.4色谱柱及进样量准确称取0.5g最佳微波提取条件下制备的粗提物粉末,色谱级甲醇定容至100ml,经0.45μm微孔过滤膜过滤后,进样分析检测。HPLC检测条件:SymmetryshieldRP18色谱柱(4.6×250mm,5μm);柱温35℃;流动相:A为甲醇,B为0.5%的磷酸水溶液,线性梯度洗脱:0~10min:A=30%,10~30min:A:30%~50%,30~40min:A=50%~60%,40~50min:A=60%~30%;流速0.6ml/min;全自动进样,进样量为10μl;200~400nm紫外全波长扫描检测,紫外选择较绿原酸最佳出峰波长329nm和各组分出峰效果较好的350nm进行分析比较。1.6heccc分离纯度1.6.1目标组分分离根据HPLC分析结果(选择绿原酸最佳出峰波长329nm和各组分出峰效果较好的350nm进行检测分析),选择化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为HSCCC主要分离目标物质,采用HPLC法测定分配系数。分配系数K=A1/A2。其中,A1为化合物溶于两相体系中的上相,经HPLC检测所对应的峰面积,A2为化合物溶于下相中的峰面积。根据K值选用合适的溶剂体系进行目标组分分离。根据文献资料,结合样品的性质,考察化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在如下的7种溶剂体系中的分配效果:(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶甲醇∶水=1∶1∶1∶1;(2)氯仿∶甲醇∶水=4∶3∶2;(3)乙酸乙酯∶正丁醇∶水=4∶1∶5;(4)乙酸乙酯∶正丁醇∶水=1∶1∶2;(5)乙酸乙酯∶正丁醇∶水=2∶1∶3;(6)乙酸乙酯∶正丁醇∶水=3∶2∶5;(7)乙酸乙酯∶正丁醇∶水=3∶1∶4。1.6.2杜仲叶微波的制备在分液漏斗中配制乙酸乙酯∶正丁醇∶水=3∶1∶4(V/V/V)的两相溶剂体系,经充分振摇后静止分相。使用前分别取上下两相超声脱气30min。取400mg杜仲叶微波粗提取,用溶剂体系的上相和下相各10ml溶解样品,备用。按HSCCC条件进行仪器设置:流速为900r/min,流速为2.0ml/min,恒温水浴30℃,254nm波长下检测,记录色谱图,根据色谱图收集目标成分。1.7分离固酸hcscc的纯度和化合物鉴定1.7.1旋转蒸干纯度检测将HSCCC分离纯化后的组分1和组分2在50℃下旋转蒸干溶于甲醇,经0.45μm微孔过滤膜过滤后,按1.5.1中HPLC条件进行纯度检测。对比出峰时间,进行定性分析。1.7.2上层液的制备上分层置展开剂为正丁醇:水:乙酸=50∶50∶0.1(V∶V∶V),充分摇匀,静置后取上层液备用。将绿原酸标品和HSCCC分离纯化所得组分1旋干物溶于乙醇溶液点样于薄层板上,展开剂分离后喷入AlCl3显色剂,得薄层图谱,计算Rf值。1.7.3紫外吸收光谱法HSCCC分离纯化所得组分1和绿原酸标品分别用无水甲醇溶解,以无水甲醇为参比,用紫外-可见分光光度计在波长200~400nm范围扫描,得到组分1和绿原酸标样的紫外吸收光谱图,进行对照分析。1.7.4组成1的电喷雾电源质量分析esi-ms取适量组分1样品旋转蒸干后用色谱纯甲醇溶解,直接进行ESI-MS分析,正离子模式,离子峰扫描范围m/z50~1000nm。1.6.5组件1的磁共振1h分析1hmr2结果与分析2.1线性关系的考察采用HPLC峰面积法绘制标准曲线,结果表明绿原酸在0~324mg/L范围内,峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,回归方程为y=12730x+3501,R2=0.9995。2.2提取方法的选择2.2.1相同条件下提取率比较由表2可知,50%丙酮水溶液和50%乙醇水溶液中,丙酮水溶液较利于绿原酸的提取,相同条件下提取率较高;微波辅助溶剂提取大大增加了提取率,不同溶剂提取率提高程度不同,丙酮水溶液提取中,绿原酸提取率提高28.7%,乙醇水溶液提取中,绿原酸提取率提高34.1%,但比较而言,还是50%的丙酮水溶液更利于绿原酸的提取。2.2.2最佳提取条件杜仲叶中绿原酸提取正交试验结果见表3。从表3可知,RD>RC>RA>RB,表明A、B、C、D4个因素对提取率影响的主次顺序为D>C>A>B;最佳提取条件为A2B2C2D2,即料液比1∶30,提取时间为25min,提取温度50℃,提取功率为400W。在此条件下进行验证试验,绿原酸提取率达2.28%。2.3杜仲叶活性成分检测采用最佳微波提取工艺法制备杜仲叶绿原酸,在1.5.4的HPLC条件下进行活性成分检测,结果见图1和图2。从杜仲叶粗提物的HPLC图比较可知,样品在10~20min之间出峰较早、极性较大的活性成分较单一;35~45min之间出峰相对晚、极性较小的黄酮苷元化合物种类较多。2.4抗高速铬处理2.4.1溶剂体系分配系数经测定(1)~(7)各溶剂体系的分层时间均在30s之内,符合HSCCC溶剂体系分层时间标准。杜仲叶粗提物主要成分化合物Ⅰ、化合物Ⅱ和化合物Ⅲ在(1)~(7)不同溶剂体系中的分配系数见表4。从表中可知,溶剂体系(3)和(7)符合HSCCC溶剂体系分配系数标准;相比溶剂体系(7)中各目标组分的分配系数相差较大,更利于HSCCC的分离,且溶剂体系(3)中上下相比例过大,造成较大量的溶剂的浪费,因此选用(7)作为溶剂体系。2.4.2heccc分离结果2.5检测波长的选择将高速逆流色谱分离纯化所得组分1和组分2旋转蒸干,用色谱纯甲醇溶解后进行HPLC纯度检测(HPLC条件同1.6.1),各精提组分的HPLC分析结果见图4和图5。由于350nm更利于后面的黄酮物质的出峰,有利于纯度的检测,因此本部分选择350nm作为组分1和2的HPLC检测波长。组分1的旋转蒸冻干物为浅绿色固体(14.5mg);由图4HPLC结果分析,纯度为98.7%;比较图2和图4的HPLC保留时间,确定组分1为化合物Ⅰ,初步推断为绿原酸。组分2的旋转蒸干物为浅黄色固体,由图5可知其为2种化合物组成的混合物,总纯度达97.3%;比较图2和图5的HPLC保留时间,确定组分2为化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的混合物,可用于高速逆流色谱的二次分离。2.6hsscc-h组结构调查2.6.1黄酮类成分分析药典方法中检测黄酮类成分的显色剂多为三氯化铝乙醇溶液。在中药分析中,与三氯化铝乙醇溶液反应呈色并产生荧光是黄酮类成分的特征鉴别方法。本试验中采用三氯化铝乙醇溶液为显色剂,检测到C上斑点呈亮黄色并带有荧光,即黄酮类成分。图6中A、B分别为绿原酸和芦丁标准品,组分2以字母C表示。如图所示,A、B2个斑点清晰,圆而集中,不拖尾,表明此展开体系对该类物质的薄层层析效果显著。结合紫外灯观察,杜仲叶精提组分2出现上下2个斑点,表明组分2含有2种化合物。各组分的Rf值见表5,其中绿原酸和芦丁Rf值分别为0.263和0.500;组分2(下)的Rf值为0.265,与绿原酸标品一致;组分2(上)的Rf值为0.453,于绿原酸与芦丁之间,说明组分2(上)在此弱极性展开体系中的极性中等,可能与结构中含有糖基有关通过比较分析,判定组分2(上)为绿原酸类物质,组分2(下)为黄酮类化合物。2.6.2紫外光谱检测称取HSCCC分离纯化后的杜仲叶精提粉末组分10.0031g,用无水甲醇溶解、定容至10ml,摇匀。以无水甲醇为参比,进行紫外扫描,紫外光谱图见图7。从图7可以看出,对组分1的波长扫描结果与绿原酸标准品相似,组分1在波长200~400nm范围的最大吸收波长是329nm,绿原酸标准品的最大吸收波长是333nm,两者最大吸收波长存在一定差异,其原因有待查。2.6.3化合物的结构鉴定组分1为浅绿色粉末,其质谱图(图8)中出现了m/z=355.1的准分子离子[M+H]+和m/z=163.0的碎片离子峰,推断m/z=163.0的碎片离子峰为化合物Ⅰ的准分子离子去掉1个m/z=192.1的1,3,4,5-四羟基环己烷羧酸基[M+H-192]+,与绿原酸标品的MS信息一致。2.6.4组件1的核磁氢谱分析图9为组分1(化合物Ⅰ)的核磁氢谱信息,与绿原酸标品的氢谱信息一致,故可确定组分1即化合物Ⅰ为绿原酸。3杜仲叶活性成分的分离纯化前期提取试验结果显示,单纯的有机溶剂浸提的提取率区别并不是很大,绿原酸约为1.4%,微波辅助提取约为1.9%,提取率提高35%以上。验证了微波辅助有机溶剂浸提在料液比、浸提温度、浸提时间等主要影响因素一致的条件下,能有效地提高绿原酸提取率。在前期分析主要影响因素的单因素试验中所得的最佳提取条件与正交试验结果一致,故在本文中没有将结果一一列出。根据参考文献结合本研究分离纯化的目的,使用丙酮水溶液作为溶剂,可使提取物含有较少杂质,纯度较高,易于后续的分离纯化。杜仲叶含有多种生物活性成分,如黄酮类、多酚类、萜类、生物碱等,其中绿原酸、黄酮类、萜类等含量较高。近年研究表明,杜仲叶与杜仲皮的有效成分基本相同,甚至某些有效成分(如绿原酸)的含量远远高于皮。绿原酸具有多种重要的药理作用,尤其具有良好的抗恶性肿瘤作用。目前,杜仲叶有效活性成分的提取分离主要采用柱分离色谱法,需经多次溶液洗脱、重结晶获取纯度较高样品,存在样品处理、试验步骤繁琐,柱污染、损坏,样品不易回收的不足;而高速逆流色谱的液液分离特点可弥补上述不足。本研究表明,采用HSCCC乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶1∶4)三元溶剂体系,可实现对杜仲叶高纯度绿原酸的一步分离纯化。近年,高速逆流色谱在天然药物活性成分提取分离方面发展迅速,但对绿原酸和黄酮类物质的分离纯化研究主要集中于金银花,对杜仲叶的HSCCC分离纯化研究甚少。同时,前人在对杜仲叶活性成分研究时仅停留于粗提取与组分的定性分析,单一组分的分离纯化以及结构鉴定甚少;本研究不仅采用HSCCC一步完成高纯度绿原酸的制备,且通过质谱技术结合核磁共振技术确定杜仲叶某单一组分为绿原酸,为杜仲叶